Механізм дії та кінетика ферментативних реакцій | Ферменти 3

Добрий день, колеги. З вами Ірина Фоменко. Я професорка кафедри біологічної хімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького. І в цій лекції я хотіла би продовжити інформацію про ферменти. І саме на цю лекцію припадає один із найскладніших фрагментів, а саме механізм дії ферментів та кінетика ферментативних реакцій. Ферменти прискорюють реакції шляхом зниження енергії активації. При цьому вони не змінюють ані вихідний енергетичний рівень реагентів, ані енергетичний рівень продуктів реакцій. Також ферменти не змінюють величину вільної енергії реакції. На графіку ліворуч показано енергетичний профіль реакції. Для того, щоб реакція відбулась, молекули повинні подолати енергетичний бар'єр, який називають енергією активації. Без ферменту цей бар'єр є високим. А фермент знижує цей бар'єр, тобто знижує енергію активації. В результаті дії ферментів значно більше молекул здатні досягнути так званого перехідного стану, а швидкість реакції різко зростає. Як же ж фермент досягає цього ефекту? Існує декілька основних механізмів. Перший механізм — це ефект зближення та орієнтації субстратів. Фермент отримує реагенти поруч один з одним у правильному просторовому положенні, що значно підвищує імовірність їхньої взаємодії. Другий механізм — кислотно-основний каталіз. В цьому випадку амінокислотні залишки активного центру можуть віддавати або приєднувати протони, полегшуючи перебіг реакції. Третій механізм — нуклеофільний каталіз. Окремі функціональні групи активного центру тимчасово взаємодіють із субстратом і утворюють проміжні сполуки, що знижує енергетичний бар'єр реакції. Четвертий механізм — електрофільний каталіз. У ньому беруть участь позитивно заряджені групи або йони металів, які стабілізують заряди, що виникають під час реакцій. Нарешті, надзвичайно важливим є механізм стабілізації перехідного стану. Саме перехідний стан має найвищу енергію і є найбільш нестабільним етапом реакції. Активний центр ферменту побудований таким чином, що найкраще зв'язує саме перехідний стан, знижуючи його енергію. Саме цей механізм сьогодні вважають одним із найважливіших пояснень високої ефективності ферментного каталізу. У процесі каталізу утворюється фермент-субстратний комплекс. Далі система проходить через перехідний стан, після чого утворюються продукти реакції, а фермент вивільняється в незміненому вигляді та може знову брати участь у каталізі. Отже, ферменти не змінюють термодинамічну можливість реакції. Вони лише забезпечують швидкий шлях досягнення того самого результату, знижуючи енергію активації та стабілізуючи перехідний стан. Саме тому ферменти не можуть зробити неможливу реакцію можливою. Вони лише багаторазово пришвидшують реакцію, яка термодинамічно може відбуватися. Упродовж історії розвитку ензимології було запропоновано декілька моделей, які пояснюють взаємодію ферменту та субстрату. Першою стала модель ключа і замка, запропонована Емілем Фішером. Згідно з цією моделлю, активний центр ферменту має жорстку, незмінну структуру, яка точно відповідає формі субстрату. Подібно до того, як лише певний ключ підходить до конкретного замка. Лише відповідний субстрат може зв'язуватися з активним центром ферменту. Ця модель добре пояснювала високу специфічність ферментів і тривалий час вважалась основною. Однак подальші дослідження показали, що білкові молекули не є жорсткими структурами. Вони можуть змінювати свою конформацію під час взаємодії з субстратом. Тому Даніел Кошланд запропонував модель індукованої відповідності. Відповідно до цієї концепції, активний центр ферменту не є абсолютно готовим до зв'язування субстрату. Після наближення субстрату відбуваються локальні конформаційні зміни, які забезпечують більш точне пристосування активного центру до субстрату. Інакше кажучи, фермент і субстрат певною мірою взаємно адаптуються один до одного. Саме ця модель краще пояснює високу каталітичну ефективність ферментів, алостеричні ефекти та здатність ферментів стабілізувати перехідний стан реакції. Сьогодні вважається, що реальна взаємодія ферменту із субстратом найближче відповідає саме моделі індукованої відповідності. Проте модель Фішера не втратила свого значення. Вона залишається дуже корисною для розуміння принципу специфічності та використовується як спрощена схема під час вивчення ензимології. Отже, сучасні уявлення розглядають фермент як динамічну структуру. Активний центр не просто зв'язує субстрат, а змінює свою форму таким чином, щоб максимально ефективно стабілізувати перехідний стан і прискорити перебіг реакцій. Саме ця здатність до конформаційних змін є однією з причин надзвичайно високої ефективності ферментативного каталізу. Тож для запам'ятовування. Якщо модель Фішера можна порівняти з готовим замком і ключем, то модель Кошланда більше нагадує рукавичку, яка дещо змінює форму, пристосовуючись до руки. Ми вже впритул підійшли до розуміння ключового поняття ферментативного каталізу, до формування комплексу фермент-субстрат. Тож на початку XX століття Леонор Міхеліс та Модментен запропонували теорію, яка стала основою сучасної ферментативної кінетики. Вони показали, що каталіз відбувається не шляхом випадкового перетворення субстрату, а через утворення важливого проміжного комплексу між ферментом і субстратом. Цей комплекс отримав назву фермент-субстратного комплексу і позначається він як комплекс ЕС. Загальну схему ферментативної реакції можна подати так. Спочатку фермент зв'язує субстрат, потім утворюється комплекс ЕС, фермент-субстратний. Далі відбувається хімічне перетворення субстрату, після чого утворюються продукти реакції, а фермент вивільняється у незмінному стані. Розглянемо ці етапи детальніше. Перший етап — зв'язування субстрату. Субстрат взаємодіє з активним центром ферменту завдяки комплементарності форми, заряду та розташування певних функціональних груп. Другий етап — утворення фермент-субстратного комплексу. У цей момент субстрат утримується в активному центрі ферменту за допомогою численних нековалентних взаємодій. Саме комплекс ЕС, тобто фермент-субстратний, є центральною ланкою всього ферментативного каталізу. І власне третій етап — каталіз у складі фермент-субстратного комплексу. Фермент утворює оптимальні умови для перебігу реакції. Відбувається зближення реагуючих груп, стабілізація перехідного стану та зниження енергії активації. В результаті субстрат перетворюється на продукт. Четвертий етап — вивільнення продукту. Продукт уже не має достатньої спорідненості до активного центру, тому залишає фермент. Фермент при цьому не втрачається і готовий розпочати новий каталітичний цикл. Тож яке значення має фермент-субстратний комплекс? По-перше, він забезпечує високу специфічність ферментативних реакцій. По-друге, дозволяє правильно орієнтувати субстрат в активному центрі. По-третє, сприяє зниженню енергії активації. І нарешті, в складі саме фермент-субстратного комплексу відбувається стабілізація перехідного стану, яка лежить в основі високої каталітичної активності ферментів. Тому утворення комплексу фермент-субстрат вважають ключовим етапом ферментативного каталізу. Саме з аналізу утворення та розпаду фермент-субстратного комплексу починається вивчення ферментативної кінетики, до якої ми переходимо далі. Тож від чого залежить швидкість ферментативної реакції? Саме це питання вивчає ферментативна кінетика. Основою сучасної кінетики є модель Міхаеліса-Ментен. Відповідно до цієї моделі фермент спочатку зв'язується з субстратом і утворює фермент-субстратний комплекс. Далі цей комплекс або розпадається на фермент і субстрат, або перетворюється на продукт реакції. Швидкість кожного з цих етапів характеризується відповідними константами швидкості. У кінцевому підсумку саме таке співвідношення між швидкістю утворення та розпаду фермент-субстратного комплексу і визначатиме швидкість усієї реакції. Тож на швидкість ферментативної реакції впливає декілька факторів. Перш за все концентрація ферменту. Чим більше молекул ферменту в системі, тим більше субстрату може перетворитись за одиницю часу. Другий ч...

ферментів та кінетика ферментативних реакцій. Ферменти прискорюють реакції шляхом зниження енергії активації. При цьому вони не змінюють ані вихідний енергетичний рівень реагентів, ані енергетичний рівень продуктів реакцій.

Також ферменти не змінюють величину вільної енергії реакції. На графіку ліворуч показано енергетичний профіль реакції. Для того, щоб реакція відбулась, молекули повинні подолати енергетичний бар'єр, який називають енергією активації. Без ферменту цей бар'єр є високим. А фермент знижує цей бар'єр, тобто знижує енергію активації.

В результаті дії ферментів значно більше молекул здатні досягнути так званого перехідного стану, а швидкість реакції різко зростає. Як же ж фермент досягає цього ефекту? Існує декілька основних механізмів. Перший механізм - це ефект зближення та орієнтації субстратів.

Фермент отримує реагенти поруч один з одним у правильному просторовому положенні. що значно підвищує імовірність їхньої взаємодії.

Другий механізм - кислотно-основний каталіз. В цьому випадку амінокислотні залишки активного центру можуть віддавати або приєднувати протони, полегшуючи перебіг реакції. Третій механізм- нуклеофільний каталіз.

Окремі функціональні групи активного центру тимчасово взаємодіють із субстратом і утворюють проміжні сполуки, що знижує енергетичний бар'єр реакції.

Четвертий механізм - електрофільний каталіз. У ньому беруть участь позитивно заряджені групи або йони металів, які стабілізують заряди, що виникають під час реакцій. Нарешті надзвичайно важливим є механізм стабілізації перехідного стану. Саме перехідний стан має найвищу енергію і найбільш нестабільним

є найбільш нестабільним етапом реакції. Активний центр ферменту побудований таким чином, що найкраще зв'язувати саме перехідний стан, знижуючи його енергію.

Саме цей механізм сьогодні вважають одним із найважливіших пояснень високої ефективності ферментного каталізу. У процесі каталізу утворюється фермент субстратний комплекс. Далі система проходить через перехідний стан, після чого утворюються продукти реакції, а фермент вивільняється в незміненому вигляді та може знову брати участь в

каталізі. Отже, ферменти не змінюють термодинамічну можливість реакції. Вони лише забезпечують швидкий шлях досягнення того самого результату, знижуючи енергію активації та стабілізуючи перехідний стан. Саме тому ферменти не можуть зробити неможливу реакцію можливою. Вони лише багаторазово пришвидшують реакцію, яка термодинамічно

може відбуватися. Упродовж історії розвитку ензимології було запропоновано декілька моделей, які пояснюють взаємодію ферменту та субстрату. Першою стала модель ключа і замка, запропонована Емілим Фішером.

Згідно з цією моделлю, активний центр ферменту має жорстку, незмінну структуру, яка точно відповідає формі субстрату. Подібно до того, як лише певний ключ підходить до конкретного замка. Лише відповідний субстрат може зв'язуватися з активним центром ферменту. Ця модель добре пояснювала високу специфічність

ферментів і тривалий час вважалась основною. Однак подальші дослідження показали, що білкові молекули не є жорсткими структурами. Вони можуть змінювати свою конформацію під час взаємодії з субстратом. Тому Даніел Кошланд запропонував модель індукованої відповідності. Відповідно до цієї концепції, активний центр ферменту не є

абсолютно готовим до зв'язування субстрату. Після наближення субстрату відбуваються локальні конформаційні зміни, які забезпечують більш точне пристосування активного центру до субстрату. Інакше кажучи, фермент і субстрат певною мірою взаємно адаптуються один до одного. Саме ця модель краще пояснює високу каталітичну

ефективність ферментів. Алостеричні ефекти та здатність ферментів стабілізувати перехідний стан реакції. Сьогодні вважається, що реальна взаємодія ферменту із субстратом найближче відповідає саме моделі індукованої відповідності. Проте модель фішера не втратила свого значення. Вона залишається дуже корисною для розуміння принципу специфічності та

використовується як спрощена схема під час вивчення ензимології. Отже, сучасні уявлення розглядають фермент як динамічну структуру. Активний центр не просто зв'язує субстрат, а змінює свою форму таким чином, щоб максимально ефективно стабілізувати перехідний стан і прискорити перебіг реакцій. Саме ця

здатність до конформаційних змін з є однією з причин надзвичайно високої ефективності ферментативного каталізу. Тож для запам'ятовування.

Якщо модель фішера можна порівняти з готовим замком і ключем, то модель Кошланда більше нагадує рукавичку, яка дещо змінює форму, пристосовуючись до руки.

Ми вже впритул підійшли до розуміння ключового поняття ферментативного каталізу, до формування комплексу ферментсубстра. Тож на початку X століття Леонор Міхеліс та Модментен запропонували теорію, яка стала основою сучасної ферментативної кінетики. Вони показали, що каталіс відбувається не шляхом випадкового перетворення субстрату, а через

утворення важливого проміжного комплексу між ферментом і субстратом. Цей комплекс отримав назву фермент субстратного комплексу і позначається він як комплекс ЕС.

Загальну схему ферментативної реакції можна подати так. Спочатку фермент зв'язує субстрат, потім утворюється комплекс ЕС, фермент субстратний. Далі відбувається хімічне перетворення субстрату, після чого утворюються продукти реакції, а фермент вивільняється у незмінному стані.

Розглянемо ці етапи детальніше. Перший етап зв'язування субстрату. Субстрат взаємодіє з активним центром ферменту завдяки комплементарності форми, заряду та розташування фер певних функціональних груп. Другий етап утворення ферментсубстратного комплексу.

У цей момент субстрат утримується в активному центрі ферменту за допомогою численних нековалентних взаємодій. Саме комплекс ЕС, тобто фермент субстратним, є центральною ланкою всього ферментативного каталізу. І власне третій етап каталіз у складі фермент субстратного комплексу фермент утворює оптимальні умови для перебігу реакції.

Відбувається зближення реагуючих груп, стабілізація перехідного стану та зниження енергії активації. В результаті субстрат перетворюється на продукт.

Четвертий етап - вивільнення продукту. Продукт уже не має достатньої спорідненості до активного центру, тому залишає фермент. Фермент при цьому не втрачається і готовий розпочати новий каталітичний цикл. Тож яке значення має ферментсубстраний комплекс? По-перше, він забезпечує високу специфічність ферментативних реакцій. По-друге,

дозволяє правильно орієнтувати субстрат в активному центрі. По-третє, сприяє зниженню енергії активації. І нарешті, в складі саме ферментсубстратного комплексу відбувається стабілізація перехідного стану, яка лежить в основі високої каталітичної активності ферментів.

Тому утворення комплексу Фермент субстрат вважають ключовим етапом ферментативного каталізу. Саме з аналізу утворення та розпаду фермент субстратного комплексу починається вивчення ферментативної кінетики, до якої ми переходимо далі.

Тож від чого залежить швидкість ферментативної реакції? Саме це питання вивчає ферментативна кінетика. Основою сучасної кінетики є модель Міхаелісаментен.

Відповідно до цієї моделі фермент спочатку зв'язується з субстратом і утворює фермент-субстратний комплекс. Далі цей комплекс або розпадається на фермент і субстрат, або перетворюється на продукт реакції. Швидкість кожного з цих етапів характеризується відповідними константами швидкості. У кінцевому підсумку саме таке співвідношення між

швидкістю утворення та розпаду ферментсубстратного комплексу і визначатиме швидкість усієї реакції. Тож на швидкість ферментативної реакції впливає декілька факторів. Перш за все концентрація ферменту. Чим більше молекули ферменту в системі, тим більше субстрату може перетворитись за одиницю часу. Другий чинник- концентрація

субстрату. При низьких концентраціях субстрату швидкість реакції зростає майже пропорційно до його кількості. Проте зі збільшенням концентрації активні центри поступово заповнюються і швидкість досягає максимального значення.

[зітхання] Особливе місце в кінетиці займає константа Міхаеліса. КМ - це один із найважливіших параметрів ферменту.

Константа Міхаеліса чисельно дорівнює концентрації субстрату, за якої швидкість реакції становить половину максимальної. Іншими словами, якщо швидкість реакції досягла половини максимальної, концентрація субстрату в цій точці і є константою міхаеліса. А біологічне значення константи Міхаеліса полягає в тому, що вона характеризує спорідненість

ферменту до субстрату. Чим менше значення константи Міхаеліса, тим вища спорідненість ферменту до субстрату. У такому випадку фермент ефективно працює навіть за невеликих концентрацій субстрату. І навпаки, високе значення КМ константи Міхаеліса свідчить про низьку спорідненість ферменту до субстрату.

Математичний опис цієї залежності отримав назву Міхаеліс, рівняння Міхаелісамент. І детально аналізувати виведення Константи Міхаеліса, представлени на цьому слайді, я не буду і навряд чи його вимагатимуть від вас ваші викладачі. Але аби ви з ним ознайомились, я його тут

представила на слайді. Тож важливо знати біологічний зміст рівняння. Швидкість ферментативної реакції залежить від концентрації субстрату та властивостей ферменту.

Таким чином, константа міхаеліса та максимальна швидкість реакції є двома основними параметрами, які використовуються для характеристики роботи фермента. Для лікаря найважливіше не запам'ятати виведення формули Міхайлі Саментин, а розуміти біологічний зміст параметрів. км, тобто константа Міхаліса, і максимальна швидкість, оскільки саме вони використовуються для

оцінки активності ферментів в нормі та при патології. Почнімо аналіз чинників, які впливають на швидкість ферментативної реакції.

Першим таким чинником є концентрація ферменту. Розглянемо ситуацію, коли концентрація субстрату є достатньо високою і не обмежує перебіг реакції. В таких умовах збільшення концентрації ферменту призводить до збільшення кількості активних центрів, доступних для зв'язування субстрату. На графіку видно, що між концентрацією ферменту та

початковою швидкістю реакції існує прямопропорційна залежність. Інакше кажучи, якщо концентрація ферменту збільшилась вдвічі, то за наявності достатньої кількості субстрату швидкість реакції також приблизно подвоїться. Чому це відбувається? Кожна молекула ферменту має власний активний центр. Чим більше ферменту присутньо в системі, тим більше

молекул субстрату можуть одночасно одночасно вступати в реакцію. В результаті швидкість утворення продукту зростає. Однак така залежність спостерігається лише тоді, коли субстрат не є лімітуючим чинником. Якщо кількість субстрату недостатня, подальше збільшення концентрації ферменту вже не призводить до сучасного до суттєвого, е,

прискорення реакції, оскільки частина активних центрів залишається незайнятою. Біологічне значення цієї закономірності полягає в тому, що клітини можуть регулювати швидкість метаболічних процесів шляхом зміни кількості ферментів. Одним із механізмів такої регуляції є зміна експресії генів. При потребі клітина синтезує більше певного

ферменту, що дозволяє пришвидшити відповідний метаболічний шлях. Таким чином, за сталих умов і достатньої концентрації субстрату початкова швидкість ферментативної реакції прямо пропорційна концентрації ферменту. Це одна із найпростіших і найважливіших закономірностей ферментативної кінетики.

Тепер розглянемо найважливіший чинник ферментативної кінетики, концентрації субстрату і обговоримо графік, про який вже згадували дещо раніше. Тож тут на графіку показано залежність початкової швидкості реакції від концентрації субстрату. На відміну від попереднього випадку, тут є залежність нелінійна. За низьких концентрацій

субстрату більшість активних центрів ферменту вільні. Ко тому кожна додаткова молекула субстрату легко знаходить фермент і вступає в реакцію. В цій ділянці швидкість реакції майже пропорційно залежна до концентрації субстрату. Проте зі збільшенням концентрації субстрату все більше активних центрів ферменту

виявляються зайнятими, про що ми вже й згадували раніше. Однак ферментативних молекул стає дедалі менше, тому швидкість продовжує зростати, але вже не так швидко. І нарешті настає момент, коли практично всі активні центри ферменту насичені субстратом. У такій ситуації фермент працює в максимально

можливі можливою швидкістю. Цю швидкість і називають максимальною швидкістю реакції або Vmax. Після досягнення максимальної швидкості подальше збільшення концентрації субстрату вже майже не впливає на швидкість реакції. Причина проста: усі ак активні центри зайняті, тому крива поступово виходить на плато.

Для характеристики спорідненісті спорідненості ферменту до субстрату використовують константу Міхаеліса. За визначенням, константа міхаеліса - це така концентрація субстрату, за якої швидкість реакції становить половину від максимальної.

На графіку ця точка відповідає значенню Vmax поді 2. Чому константа Міхаеліса така важлива? Вона дозволяє оцінити наскільки легко фермент зв'язує субстрат. Якщо значення константи Міхаеліса невелике, це означає, що фермент досягає половини максимальної швидкості вже за низької концентрації субстрату. Отже, такий фермент має

високу спорідненість до субстрату. Якщо ж константа міхаліса велика, то для досягнення тієї самої швидкості потрібна значно вища концентрація субстрату. У цьому випадку спорідненість ферменту до субстрату значно нижча. Математично ця залежність описується рівнянням Міхеліса Мен. Проте для нас зараз важливіше

зрозуміти його біологічний зміст. Швидкість реакції визначається двома основними параметрами: максимальною швидкістю ферменту, тобто Vmax, та спорідненістю ферменту до субстрату, тобто константою Міхаеліса.

Таким чином, збільшення концентрації субстрату прискорює реакцію лише до певної межі. Після насичення ферменту швидкість досягає максимального значення і більше практично не зростає. Щоб краще зрозуміти, як це працює, уявіть собі автомобільну парковку. На початку місць багато, тому кожна нова машина легко

знаходить вільне місце. Але коли парковка майже заповнена, знайти місце стає складніше. А коли всі місця зайняті, прибуття нових автомобілів вже не збільшує кількість припаркованих машин. Саме так поводиться фермент під час насичення субстратом.

Ми вже побачили, що залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату має гіперболічний характер. Така крива насправді добре описує реальну роботу ферментів. Однак створює певні труднощі під час визначення важливих кінетичних параметрів. Особливо складно точно встановити значення максимальної швидкості Vmax, оскільки

крива лише поступово наближається до неї. Для розв'язання такої проблеми було запропоновано графік Іленуївера Берка.

Його ще називають подвійно оберненим графіком, оскільки замість безпосередньої швидкості реакції та концентрації субстрату використовують їхні обернені величини, тобто одиницю поділену на швидкість і одиницю поділену на концентрацію субстрату. В результаті гіперболічна залежність перетворюється на пряму лінію. Це значно спрощує

визначення основних кінетичних параметрів ферменту. З графіка можна безпосередньо визначити максимальну швидкість реакції, тобто VК. Для цього використовують точку перетини перетину прямої з віссю ординат. Також можна визначити константу Міхаеліса. Для цього аналізують точку перетину прямої з віссю абсцис.

Крім того, нахил прямої містить інформацію про співвідношення між ВМКМ та Vмак. Саме тому графіки Лануївераберка тривалий час були одними із найпоширеніших інструментів для дослідження ферментативної кінетики.

Такий графік особливо корисний для порівняння різних ферментів, а також для аналізу дій інгібіторів та активаторів.

Проте цей метод має і певні недоліки. Оскільки використовуються обернені величини, навіть невеликі експериментальні похибки при низьких концентраціях субстрату можуть суттєво впливати на результат. Тому сьогодні в наукових дослідженнях частіше використовують методи нелінійної регресії та комп'ютерного моделювання.

Проте графік Ланоївера Берка залишається надзвичайно важливим. навчальним інструментом, який дозволяє зрозуміти взаємозв'язок між швидкістю реакції, константою Міхеліса та максимальною швидкістю ферменту. І ще раз, головна цінність графіка Луновераберка полягає в тому, що він дозволяє легко визначити два найважливіших кінетичних параметри

ферменту Vmax та KM. Одним із найважливіших чинників, що впливає на швидкість ферментативної реакції, є температура.

Підвищення температури призводить до збільшення кінетичної енергії молекули, як ви вже вивчали раніше в курсі медичної хімії. Молекули рухаються швидше, частіше стикаються одна з одною, тому швидкість ферментативної реакції зростає. І це ми бачимо на графіку. Зі збільшенням температури швидкість

реакції спочатку поступово підвищується, але це відбувається лише до певного значення. І це значення називається температурним оптимумом. Температурним Температурний оптимум - це та температура, за якою фермент проявляє максимальну активність. Для більшості ферментів людини цей показник становить близько 37° C, що відповідає нормальній

температурі тіла людини. Однак не всі ферменти мають однаковий температурний оптимум. До прикладу, ферменти термофільних мікроорганізмів здатні ефективно працювати за температур 60-70 і навіть понад 80° C. Саме тому їх широко застосовують в біотехнології та молекулярній біології.

Після досягнення оптимальної температури подальше нагрівання вже не підвищує швидкість реакції. Навпаки, активність ферменту починає знижуватись. Причина полягає в тому, що висока температура по порушує слабкі нековалентні взаємодії, які підтримують просторову структуру білка. У результаті виникає денатурація, порушується будова активного центру,

фермент втрачає здатність зв'язувати субстрат і каталізувати реакцію. Саме тому права частина графіку демонструє різке зниження швидкості реакції. Розглянемо декілька прикладів.

Лізосомальні ферменти людини працюють найефективніше при температурі близько 37° C. Пепсин і трипсин також проявляють максимальну активність поблизу фізіологічної температури. Натомість термостабільна ДНК полімераза, так звана так полімераза, яку отримують із бактерій термусакс.

має температурний оптимум близько 72° C. Саме ця властивість дозво дозволяє використовувати її в полімеразній ланцюговій реакції.

Отже, вплив температури на активність ферментів має двоїстий характер. Помірне підвищення температури пришвидшує реакцію, надмірне нагрівання викликає денатурацію ферменту та втрату його активності. Тому для кожного ферменту існує свій власний температурний оптимум, за якого каталітична ефективність є максимальною. Саме тому

правила тривала гіпертермія може порушувати перебіг багатьох ферментативних процесів організмів, а підтримання сталої температури тіла є важливою умовою для нормального метаболізму.

Окрім температури, на активність ферментів надзвичайно сильно впливає pH середовища. Нагадаю, що ферменти є білками, отже містять амінокислоти з кислотними та основними функціональними групами. Зміна pH призводить до зміни ступеня йонізації цих груп. Отже, впливає на заряд білкової молекули та відповідно на

структуру активного центру. У результаті може змінюватись здатність ферменту зв'язувати субстрат і здійснювати каталіз. Для кожного ферменту існує свій власний оптимум pH, тобто значення за якого його активність є максимальною.

На графіку можна побачити, що різні ферменти мають різні оптимальні значення pH. До прикладу, пепсин працює в сильнокислому середовищі зі значенням приблизно півтора-два.

Це повністю відповідає умовам шлунка, де цей фермент бере участь у перетравленні білків. Трипсин, навпаки, проявляє максимальну активність у слабколужному середовищі з pH близько вісім. Саме такі умови створюються у дванадятипалій кишці завдяки надходженню бікарбонатів підшлункової золози.

Слина амілаза працює поблизу нейтрального pH, що відповідає умовам ротової порожнини. Отже, оптимум pH- ферменту тісно пов'язаний із тим середовищем, де цей фермент функціонує в організмі. Чому ж зміна pH впливає на активність ферменту? Перш за все через зміну стану заряду амінокислотних залишків.

При зміні pH можуть руйнуватись йонні та водневі зв'язки, які підтримують просторову структуру білка. Крім того, змінюється заряд функціональних груп активного центру. Якщо ці групи втрачають необхідний заряд, фермент уже не може ефективно зв'язувати субстрат або здійснювати каталіз.

За значних відхилень PH від оптимальних значень можливі більш серйозні наслідки. Порушуються внутрішньомолекулярні взаємодії, змінюється просторова структура білка, а в крайніх випадках розвивається денатурація.

У результаті фермент повністю втрачає свою активність. Саме тому організм підтримує досить вузькі межі кислотно-основного стану. Навіть незначні зміни pH можуть впливати на активність багатьох ферментативних систем. Особливо це стосується крові, де нормальний pH підтримується в межах приблизно 735 до 745.

Таким чином, pH є одним із найважливіших чинників регуляції ферментативної активності. Для кожного ферменту існує власний оптимум pH, який забезпечує правильну просторову організацію активного центру та максимальну швидкість ее реакції. Саме тому при ацидозі або алкалозі змінюється активність багатьох ферментів, що може

призводити до порушення обміну речовин і функцій органів. Отже, ми говорили про швидкість ферментативних реакцій, концентрацію субстрату, константу міхеліса та чинники, що впливають на активність ферментів. [зітхання][хекання] Однак виникає практичне питання, як кількісно оцінити активність ферменту.

Для цього використовують поняття ферментативної активності. Ферментативна активність - це здатність ферменту каталізувати перетворення певної кількості субстрату на продукт за одиницю часу в строго визначених умовах.

Важливо пам'ятати, що активність залежить не лише від самого ферменту, але і від температури, pH, концентрації субстрату та інших умов проведення реакції. Тому всі вимірювання виконують у стандартизованих умовах.

Для кількісної оцінки активності використовують декілька одиниць. Найпоширенішою міжнародною одиницею активності є міжнародна одиниця або юніт.

Е-е одиниця, одна одиниця міжнародна відповідає такій кількості ферменту, яка каталізує перетворення одного мікромоля субстрату за 1ну хвилину. У наукових дослідженнях також використовують одиницю катало. Один катал - це така кількість ферменту, яка перетворює 1 моль субстрату за одну секунду. Це дуже велика одиниця, тому в

біохімічній практиці частіше застосовують її похідні мікрокатали або навіть нанокатали. Окрім загальної активності, часто використовують і питому активність ферменту. Питома активність показує, скільки одиниць активності припадає на 1 мг білка. Цей показник особливо важливий під час очищення ферментів. Чим вища

питома активність препарату, тим вищий ступінь його очищення. Клінічне значення ферментативної активності надзвичайно велике. Саме вимірювання активності ферментів лежить в основі багатьох лабораторних досліджень. І приклади ферментів, активність яких використовують у клінічній практиці, ви можете побачити на слайді, а також ми

будемо розглядати їх більш детально в одній з наступних лекцій. Існує три основні способи визначення активності ферментів. Перший підхід полягає у визначенні кількості продукту реакції, що утворюється за певний проміжок часу. У цьому випадку ми запускаємо ферментативну реакцію і вимірюємо накопичення продукту. Чим

швидше накопичується продукт, тим вища активність ферменту. Саме цей підхід широко використовують у спектрофотометричних, флурометричних та хроматографічних методах аналізу. Наприклад, активність амілази можна оцінити за швидкістю утворення продуктів гідролізокрохмалю.

Другий підхід базується на визначенні швидкості зникнення субстрату. Тут оцінюють не утворення продукту, а навпаки швидкість споживання вихідної речовини. Чим швидше зменшується концентрація субстрату, тим вища активність ферменту. Такий принцип використовують для визначення активності урази, аргінази та багатьох інших ферментів.

Третій підхід особливо важливий для оксидоредуктаз. У цьому випадку вимірюють зміну концентрації коферментів, які беруть участь в окисновідновних реакціях.

Найчастіше використовують коферменти над та над H. Особливість полягає в тому, що відновлена форма, тобто надаш, добре поглинає ультрафіолетове світло при довжині хвилі в 340 нм, тоді як окиснена форма практично не поглинає. Тому, спостерігаючи за зміною оптичної густини при 340 н, можна безпосередньо оцінити

швидкість реакції. Саме цей приклад, принцип лежить в основі визначення активності більшості дегідрогеназ. Наприклад, лактат дегідрогенази, малад дегідрогенази, алкоголь дегідрогенази та інших ферментів. Таким чином, незалежно від конкретної методики, ферментативна активність завжди оцінюється через швидкість реакції. Ми можемо виміряти швидкість утворення продукту, зниження

концентрації субстрату або зміну концентрації коферментів. Вибір конкретного методу залежить від природи ферменту, особливості реакцій та відповідної доступних аналітичних методів.

Для визначення активності ее ферментів використовують цілий спектр різноманітних методів. Найпоширенішими методами є оптичні методи, а серед них спектрофотометрія.

Як ми вже обговорювали в одній із попередніх лекцій, спектрофотометричні методи базуються на здатності речовин поглинати світло певної довжини.

Ее ще з оптичних методів використовуються флуориметричні методи. теж не зупинятимусь е-е більш детально, оскільки вже про це пояснювала.

Для дослідження окисновідновних процесів часто використовують електрохімічні методи. Е-е для розділення використовують хроматографічні методи. Також використовуються імунохімічні методи, зокрема метод імуноферментного аналізу.

Більш детально хотіла б зупинитись на одному із сучасних методів, про який не розповідали раніше на масспектрометрії.

Цей метод дозволяє визначити масу молекул і аналізувати склад дуже складних біологічних зразків. Саме маспектрометрія сьогодні є одним із ключових інструментів для протеоміки і метаболоміки.

Окрему групу становлять тетриметричні методи. Вони ґрунтуються на визначення кількості реагенту, який вступив в реакцію з субстратом або продуктом. Хоча сьогодні їх використовують рідше, вони залишаються важливими в біохімічному аналізі. Ще одним прикладом є нефелометричні та турбідеметричні методи. У цих методах оцінюють

розсіювання або поглинання світла завислими частинками, що утворюються під час реакції. Вибір конкретного методу залежить від багатьох чинників: природи, ферменту, необхідної чутливості, доступного обладнання, а також завдань дослідження.

Отже, ми розглянули кінетику ферментативних реакцій, чинники, які впливають на швидкість ферментативні реакції та визначення активності ферментів. А далі ми поговоримо в наступній лекції про те, які ж існують шляхи регуляції ферментів і як це можна використати в медицині. Yeah.