Speaker 1
Abbiamo appena effettuato una PCR.
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Speaker 1
Come facciamo a sapere che tutto è andato bene?
Speaker 1
Come facciamo a sapere che la reazione a catena della polimerasi ha funzionato?
Speaker 1
Utilizzando l'elettroforesi su gel, una tecnica di laboratorio che serve a separare i frammenti di DNA in base alle loro dimensioni.
Speaker 1
Parliamo adesso dell'elettroforesi su gel.
Speaker 1
L'elettroforesi su gel è una tecnica di laboratorio che serve a separare i frammenti di DNA in base alle loro dimensioni e alla loro carica.
Speaker 1
In realtà si può utilizzare l'elettroforesi su gel anche per separare molecole di RNA o proteine, ma restiamo sul DNA.
Speaker 1
Tutte le molecole di DNA hanno la stessa quantità di carica per massa.
Speaker 1
E allora, l'elettroforesi su gel separa i frammenti di DNA solo in base alle loro dimensioni.
Speaker 1
Come spesso facciamo, partiamo dall'analisi dei termini.
Speaker 1
Elettroforesi è un termine composto dal prefisso elettro, che si riferisce all'utilizzo di elettricità nella tecnica.
Speaker 1
E dal suffisso foresi, che deriva dal greco foresis, che significa trasporto.
Speaker 1
Su gel, perché il trasporto tramite elettricità coinvolge un gel.
Speaker 1
Nell'elettroforesi su gel, i campioni vengono separati facendoli muovere.
Speaker 1
In gergo correre in un gel attraverso l'utilizzo dell'elettricità.
Speaker 1
Ma andiamo con ordine.
Speaker 1
Primo step di una elettroforesi su gel è.
Speaker 1
Il gel utilizzato nell'elettroforesi è solitamente un gel di agarosio.
Speaker 1
E si prepara sciogliendo ad alta temperatura l'agarosio, un polisaccaride che viene estratto da un'alga, in una soluzione acquosa detta buffer.
Speaker 1
Dopo che l'agarosio si è completamente e uniformemente sciolto, la soluzione viene versata all'interno di uno stampo.
Speaker 1
Per permetterne la solidificazione, ovvero la formazione di una lastra di materiale gelatinoso.
Speaker 1
Occhio, in questo step è importantissimo non dimenticarsi di inserire un pettinino, di solito di plastica, ad una delle due estremità, al suo posto, nello stampo.
Speaker 1
Il pettinino serve, infatti, a permettere la formazione dei pozzetti, degli spazi rimasti vuoti, cioè senza gel.
Speaker 1
Diciamo dei solchi nel gel, che saranno fondamentali nello step di caricamento dei campioni da analizzare.
Speaker 1
Prima di andare avanti, vi devo chiedere di immaginare il gel.
Speaker 1
A livello molecolare, come una rete di pori.
Speaker 1
Questi pori consentono di separare le molecole in base alla loro grandezza.
Speaker 1
E il gel funge, quindi, da setaccio.
Speaker 1
La larghezza delle maglie del gel dipende dalla concentrazione di agarosio nel gel.
Speaker 1
E viene scelta in base al tipo di molecole di DNA che si vuole analizzare.
Speaker 1
Se DNA di grandi dimensioni, abbiamo bisogno di avere pori grandi nel gel.
Speaker 1
In modo da permettere il passaggio di DNA di grandi dimensioni.
Speaker 1
In questo caso, scegliamo una concentrazione di agarosio più bassa.
Speaker 1
Se dobbiamo analizzare DNA di piccole dimensioni, invece, abbiamo bisogno di avere pori piccoli nel gel.
Speaker 1
In modo da aumentare la risoluzione della separazione.
Speaker 1
In questo caso, scegliamo una concentrazione di agarosio più alta.
Speaker 1
Dopo lo step di preparazione del gel, mi raccomando ai pozzetti.
Speaker 1
Questo viene posizionato all'interno di un contenitore per elettroforesi.
Speaker 1
Il contenitore per l'elettroforesi, detto cella elettroforetica, in questo caso orizzontale.
Speaker 1
È una piccola vasca con un'importante peculiarità.
Speaker 1
È collegato ad un elettrodo positivo da un lato e ad un elettrodo negativo dall'altro.
Speaker 1
Per procedere, bisogna posizionare il gel solido appena preparato nella cella elettroforetica.
Speaker 1
E versarci sopra, fino a copertura del gel, una soluzione acquosa detta buffer.
Speaker 1
Fondamentale è l'orientamento con cui si inserisce il gel nella cella elettroforetica.
Speaker 1
Il lato del gel con i pozzetti deve essere posizionato dalla parte dell'elettrodo negativo.
Speaker 1
Il lato del gel senza pozzetti deve essere posizionato dalla parte dell'elettrodo positivo.
Speaker 1
Posizionato il gel e versato il buffer sopra di esso, è il momento di caricare all'interno dei pozzetti.
Speaker 1
All'interno dei solchi del gel creati dal pettinino, i campioni di DNA da analizzare, addizionati con un buffer di caricamento.
Speaker 1
La composizione del buffer di caricamento è pensata per appesantire i campioni di DNA, in modo tale da farli depositare sul fondo del pozzetto.
Speaker 1
E per permettere allo sperimentatore di seguire visivamente la corsa su gel e accorgersi di quando la corsa elettroforetica è terminata.
Speaker 1
Ultimo step, dopo il caricamento dei campioni nei pozzetti, è quello di collegare gli elettrodi alla corrente.
Speaker 1
Per permettere alla corrente di iniziare a fluire attraverso il gel e, quindi, far partire la corsa elettroforetica.
Speaker 1
Ora, se vi ricordate, le molecole di DNA sono complessivamente cariche negativamente a causa dei molti gruppi fosfato.
Speaker 1
Presenti nello scheletro zucchero fosfato che costituisce i due filamenti del DNA.
Speaker 1
In quanto cariche negativamente, le molecole di DNA, una volta fatta partire la corsa elettroforetica.
Speaker 1
Tendono a correre verso il polo positivo.
Speaker 1
I campioni di DNA devono essere caricati al polo negativo della cella elettroforetica.
Speaker 1
Perché, in questo modo, il DNA può muoversi dal polo negativo a quello positivo.
Speaker 1
Ed ecco spiegato perché è fondamentale posizionare i pozzetti.
Speaker 1
I solchi del gel in cui vengono caricati i campioni di DNA, dal lato dell'elettrodo negativo.
Speaker 1
Al termine dell'elettroforesi o corsa elettroforetica, cioè quando i frammenti di DNA.
Speaker 1
Presenti nei campioni da analizzare, hanno corso a sufficienza.
Speaker 1
Bisogna analizzare i risultati.
Speaker 1
Riprendete l'immagine mentale che vi avevo chiesto di farvi.
Speaker 1
Del gel a livello molecolare.
Speaker 1
L'immagine di una rete di pori che fa da setaccio.
Speaker 1
Questa immagine ci permette adesso di capire perché le molecole di DNA più piccole, riuscendo ad infilarsi più facilmente nei pori del gel.
Speaker 1
Corrono più lontano dai pozzetti.
Speaker 1
Rispetto alle molecole di DNA più grandi che, infilandosi meno facilmente nei pori del gel, restano più vicine ai pozzetti.
Speaker 1
Capito questo concetto alla base dell'analisi dei risultati di un elettroforesi su gel.
Speaker 1
Ci manca solo di capire come rendere visibili i campioni di DNA che hanno corso nel gel.
Speaker 1
Ci manca allora di parlare dei coloranti per l'elettroforesi.
Speaker 1
I coloranti per l'elettroforesi sono molecole intercalanti.
Speaker 1
Cioè molecole che si inseriscono all'interno della struttura delle molecole di DNA, rendendole visibili alla luce UV.
Speaker 1
Questi coloranti possono essere aggiunti direttamente nella preparazione del gel.
Speaker 1
O essere aggiunti ai campioni di DNA prima del loro caricamento nei pozzetti.
Speaker 1
L'utilizzo dei coloranti che si intercalano al DNA permette la visualizzazione dei frammenti di DNA sotto forma di bande brillanti.
Speaker 1
All'interno del gel esposto ai raggi UV.
Speaker 1
I DNA ladder, infine, sono marcatori dimensionali.
Speaker 1
Cioè prodotti commerciali che si fanno correre nel gel insieme ai campioni da analizzare e che funzionano da standard.
Speaker 1
In quanto contenenti frammenti di DNA di dimensioni note.
Speaker 1
Un DNA ladder, in pratica, è uno standard che si usa per comparare le bande di DNA presenti nei campioni.
Speaker 1
Con bande di DNA di dimensioni note.
Speaker 1
I DNA ladder vengono venduti corredati da un'immagine leggenda che affianca ad ogni banda elettroforetica.
Speaker 1
Del marcatore le sue dimensioni in paia di basi.
Speaker 1
La comparazione tra la corsa elettroforetica dei campioni da analizzare e la corsa elettroforetica dei frammenti di dimensione nota presenti nel DNA ladder.
Speaker 1
Permette di ottenere una stima delle dimensioni dei frammenti di DNA presenti nei campioni analizzati.
Speaker 1
Ci siamo, allora.
Speaker 1
Bande più vicine ai pozzetti sono costituite da frammenti di DNA più grandi.
Speaker 1
Mentre bande più lontane dai pozzetti sono costituite da frammenti di DNA più corti.
Speaker 1
Ma non solo.
Speaker 1
Caricando in uno dei pozzetti un DNA ladder, dopo la corsa elettroforetica.
Speaker 1
Possiamo confrontare le bande dei nostri campioni con le bande dei frammenti di DNA presenti nel DNA ladder.
Speaker 1
E stimare, così, le dimensioni dei frammenti di DNA presenti nei nostri campioni.
Speaker 1
L'elettroforesi su gel è una tecnica che serve a rendere possibile la visualizzazione di frammenti di DNA.
Speaker 1
È una tecnica che ci permette di vedere quanti diversi tipi di frammenti di DNA sono presenti in un campione.
Speaker 1
E di stimare le loro dimensioni.
Speaker 1
L'elettroforesi su gel ci permette di analizzare il DNA.
Speaker 1
Perché ci permette di vederlo.
Speaker 1
Per adesso vi ringrazio per l'attenzione e vi invito a restare connessi con me e con la biologia.
Speaker 1
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Speaker 1
Fatemi sapere se vi sono stata di aiuto con like e commenti.
Speaker 1
E come sempre, buono studio a tutti.
