EPP sur gel et électrophorèse capillaire (Exploration-d… — Transcript

Présentation des méthodes d'exploration des dysprotéinémies : dosage des protéines totales, électrophorèse sur gel et électrophorèse capillaire.

Key Takeaways

Le dosage des protéines totales est essentiel pour détecter une hypo- ou hyperprotéinémie avant toute exploration complémentaire.
La méthode de Biuret est simple, rapide et fiable mais peu sensible pour les faibles concentrations.
L'électrophorèse permet de fractionner les protéines plasmatiques selon leur charge et taille, facilitant le diagnostic des dysprotéinémies.
L'électrophorèse capillaire est une technique moderne offrant une meilleure résolution et compatibilité avec divers détecteurs.
Les méthodes immunologiques sont nécessaires pour doser des protéines plasmatiques à très faible concentration.

Summary

Définition des dysprotéinémies comme perturbations quantitatives des protéines plasmatiques.
Importance du dosage des protéines totales dans le sérum comme première étape du diagnostic.
Description de la méthode colorimétrique de Biuret pour doser les protéines totales, ses principes, avantages et limites.
Présentation du réactif rouge pyrogallol pour le dosage des protéines dans les urines et le LCR.
Introduction à l'électrophorèse des protéines plasmatiques, principes et supports utilisés (gel d'acétate de cellulose, agarose, polyacrylamide).
Détail du protocole pratique de l'électrophorèse sur gel d'agarose, préparation et mise en place du gel.
Explication de l'électrophorèse capillaire comme technique récente, qualitative et quantitative.
Comparaison entre électrophorèse sur gel et électrophorèse capillaire en termes de résolution et compatibilité avec détecteurs.
Indications cliniques de l'électrophorèse des protéines plasmatiques en cas d'altération de l'état général ou syndrome inflammatoire.
Mention des méthodes immunologiques pour le dosage des protéines à faible concentration, notamment les immunoglobulines.

Chapters

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Speaker A

Salut tout le monde, j'espère que vous allez bien. Pour cette vidéo, on va voir ensemble sur le cours des 10 protéinémies, mais juste une partie sur la pratique et le diagnostic biologique, à savoir les méthodes d'exploration. Suivez avec moi. Alors, avant de commencer, on doit

Speaker A

définir c'est quoi les 10 protéinémies. Donc, c'est une perturbation quantitative des protéines plasmatiques qui se manifeste soit par une augmentation ou une diminution de l'ensemble des protéines, ou bien groupe de protéines, ou bien une seule protéine plasmatique. Les méthodes d'investigation

Speaker A

qui permettent d'obtenir une analyse simultanée de ces protéines comprennent des méthodes qualitatives, des méthodes semi-quantitatives et des méthodes quantitatives. L'exploration des 10 protéinémies commence toujours par le dosage des protéines totales dans le sérum. Ça, c'est la première étape.

Speaker A

Pourquoi ? Pour rechercher une hypo ou une hyperprotéinémie. Il faut savoir que cette détermination elle doit être toujours accompagnée de la mesure de l'hématocrite. Pourquoi ? Pour écarter une éventuelle hémoconcentration ou une dilution. Pour ce qui concerne le prélèvement du sang pour

Speaker A

doser les protéines totales, alors il se fait soit sur tube sec ou sur tube hépariné. Les deux sont valables, mais on préfère le tube sec parce que généralement, au cours des 10 protéinémies, le dosage de TP il est suivi

Speaker A

par l'électrophorèse, et on sait très bien que le PP il se fait uniquement sur tube sec pour éliminer la migration de la fibrine qui ne donne une bande en bêta sur le tracé électrophorétique. Pour ce qui concerne la valeur de TP dosé

Speaker A

sur le tube hépariné, c'est une valeur majorée de 3 g par litre. Pourquoi ? Parce qu'elle est due aux protéines fibrinogènes et les facteurs de coagulation. Voici une photo qui nous représente du sang prélevé sur tube sec. Là, on voit le sérum avec la

Speaker A

fibrine. La méthode couramment utilisée au laboratoire pour doser les protéines totales dans le sérum, bien sûr, c'est la méthode colorimétrique, la méthode de Biuret. Le principe est simple : au milieu alcalin, les ions du cuivre Cu2+ de la solution

Speaker A

Co4V vont réagir avec les liaisons peptidiques pour donner un complexe coloré violet pourpre. L'intensité de coloration mesurée à une longueur d'onde de 546 nanomètres est proportionnelle à la concentration des protéines dans les échantillons. Donc, la réaction elle est

Speaker A

simple : le sérum qu'on va rajouter au réactif de Biuret nous donne la coloration violet pourpre. L'intensité, c'est-à-dire plus la couleur est très foncée, plus l'échantillon contient beaucoup de protéines, et vice-versa. Une remarque : pour que ce complexe se forme, il faut au moins de

Speaker A

liaisons peptidiques. La connaissance de la composition du réactif de Biuret, ce qu'on appelle aussi le réactif de Gournal, est très importante, surtout pour les biochimistes afin de comprendre la réaction. Alors, le réactif de Biuret il contient les sulfates de cuivre, c'est

Speaker A

une source des ions cuivreux, c'est ce cuivre qui rentre dans la réaction avec les protéines. Il contient aussi du NaOH, dont le rôle c'est pour créer un milieu alcalin parce que la réaction elle se déroule dans un milieu alcalin.

Speaker A

Du dur de potassium, le rôle c'est d'inhiber la réduction de Cu2+ et enfin il contient aussi le tartrate double de potassium et de sodium. Le rôle du tartrate c'est de chélater le cuivre pour éviter sa précipitation. On va citer les avantages

Speaker A

et les inconvénients de la méthode de Biuret. Pour les avantages, alors c'est une méthode rapide, automatisable, elle est simple, fiable, elle a une bonne linéarité qui arrive jusqu'à 120 g par litre et possède une bonne répétabilité. Par contre, les

Speaker A

inconvénients : elle est peu sensible, sa limite de détection elle est entre 8 et 10 g par litre, présence des interférences, par exemple l'hémoglobine, et elle est non applicable pour doser les protéines dans les urines et LCR puisque la méthode de Biuret elle est

Speaker A

peu sensible, ne permet pas de doser les protéines dans les échantillons faiblement concentrés comme les urines et LCR. Il existe un autre réactif qui est couramment utilisé au laboratoire pour doser les protéines dans les urines et LCR, le fameux rouge pyrogallol. Le principe

Speaker A

de la méthode est simple : en milieu acide, le contraire du Biuret au milieu alcalin, mais le rouge pyrogallol c'est au milieu acide. Le rouge pyrogallol il se fixe sur les groupements aminés des protéines pour donner un complexe coloré en bleu.

Speaker A

La mesure elle se fait à une longueur d'onde de 600 nanomètres et le domaine de mesure il est entre 0,5 et 5 g par litre. Une fois qu'on a dosé les protéines dans le sang et qu'on a trouvé une valeur anormale,

Speaker A

soit hyper ou hypo, la deuxième étape qu'on doit faire c'est l'électrophorèse des protéines plasmatiques, deux types : soit sur gel ou une électrophorèse capillaire qu'on va voir par la suite. Maintenant, on va définir l'électrophorèse. Donc, c'est une technique de

Speaker A

séparation qui consiste à faire migrer et à fractionner les protéines dans un champ électrique au sein d'un milieu tamponné de pH déterminé, et la séparation elle se fait selon la charge et la taille des protéines. Maintenant, quel est le principe de

Speaker A

l'électrophorèse ? Elle consiste à déposer le sérum sur le support, le gel, dans un tampon de pH alcalin, le pH est égal à 8,6. Les protéines vont s'ioniser négativement et la migration elle se fait vers l'anode, c'est-à-dire chargée positivement. Plusieurs supports et

Speaker A

plusieurs colorants sont utilisés pour réaliser une électrophorèse des protéines plasmatiques sur gel. Alors, pour les supports, par exemple le gel d'acétate de cellulose, le gel d'agarose, le gel polyacrylamide ou là polyacrylamide plus SDS. Pour les colorants utilisés : l'amide

Speaker A

au Schwarz, rouge ponceau, vert de léamine et bleu de Coomassie. Alors, la différence entre les supports, par exemple l'acétate de cellulose, permet la séparation en fonction de la charge seulement. Le colorant utilisé c'est le rouge ponceau.

Speaker A

L'acétate de cellulose permet de nous donner cinq fractions : l'albumine, alpha 1, alpha 2, bêta 1 et gamma. Par contre, le gel d'agarose, la séparation elle se fait en fonction de la charge et la taille. Il est plus résolutif, pourquoi ? Parce que la

Speaker A

bande bêta en bêta 1 et bêta 2. Pour le gel polyacrylamide, la séparation elle se fait en fonction de la charge et la masse moléculaire. Elle est plus résolutive. Et le gel polyacrylamide plus SDS, dans ce cas-là, la séparation elle

Speaker A

se fait en fonction de la masse moléculaire seulement. Dans cette planche, je vais vous expliquer le principe et la pratique de l'électrophorèse sur gel d'agarose, c'est-à-dire je vais vous dire quelles sont les étapes à suivre pour réaliser cette technique. Tout d'abord, on

Speaker A

doit disposer du matériel à savoir la cassette d'électrophorèse qui contient deux réservoirs de tampons qui sont séparés par une cloison, le support de gel, les électrodes de platine cathode et l'anode, des câbles électriques qui relient

Speaker A

la cassette d'électrophorèse avec un générateur en tension. Bien sûr, on a besoin du tampon électrophorétique et la plaque, la plaque ou le gel d'agarose, et aussi le sérum de malade. La première étape consiste à préparer le gel d'agarose dans le

Speaker A

support de collage. Alors, comment on doit dissoudre la poudre d'agarose dans un tampon spécifique en chauffant la solution dans un micro-ondes par période de 15 minutes jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissoute. Et bien sûr, on doit avoir une solution claire comme

Speaker A

l'eau. Puis on va laisser refroidir un peu. Par la suite, on va verser la solution d'agarose refroidie dans le support de collage. Le gel devrait se solidifier au bout de 20 minutes maximum, et à ce moment-là, le gel il devient moins transparent en se

Speaker A

solidifiant par rapport à la solution elle-même. Par la suite, on va, une fois le gel prêt, enlever les vis de jointure et le peigne, et bien sûr il faut prendre soin

Speaker A

d'éviter d'endommager les puits, puis placer le gel sur la cassette d'électrophorèse ou là sur le support. Donc, une fois le gel prêt, on le place ici. Par la suite, on doit verser le tampon d'électrophorèse dans les réservoirs,

Speaker A

les deux, mais la condition c'est...

Speaker A

chaque sérum on va le verser dans chaque puit par la suite on va fermer le couvercle de sécurité et faut vérifier que le gel il est placer dans la dans la bonne direction à la fin on va brancher

Speaker A

les prises à la source de courant et réaliser l'électroporèse une fois que l'électroporè a été complète on va retirer le gel et les transférer pour sa visual sa visualisation bien sûr on va effectuer une fixation coloration lecture photodensitométrique de la

Speaker A

coloration pour chaque pentete et on aura à la fin ce résultat maintenant on va parler sur l'électroporace capillaire qui est une technique récente de séparation analytique elle est destinée à l'analyse qualitative et quantitative donc les composés de mélange sont un

Speaker A

injecté dans des capillaires très étroits le plus fréquemment de silice et sont séparés à l'aide de tons alcalin sous l'effet de d'un champ électrique et la séparation elle se fait grâce à leur à leur différence de mobilité donc on a

Speaker A

une vitesse de migration rapide et meilleure le détecteur permet ensuite de visualiser cette séparation sur un électroperrogramme un ex exemple d'appareil c'est l'appareil cbia ou la minicap maintenant quel est le principe de l'électroforace capillaire il faut savoir que la séparation des composés

Speaker A

résulte de deux mécanismes de transporten l'électromigration et l'électroosmose je vais définir les deux alors l'électromigration ce qu'on appelle la migration électrophorétique elle résulte du déplacement de la substance à séparé la substance à séparé qui peut être des protéines des C des

Speaker A

agnons des acides aminés et cetera lorsqu'elle est soumise à un champ électrique la migration elle s'effectue dans le sens du champ électrique on appelle une mobilité électrophorétique positive c'est-à-dire vers la cathode euh lorsque la substance a séparé sont

Speaker A

des cationss et dans le sens opposé c'est-à-dire euh vers l'anote lorsqu'il s'agit des agonss et dans ce cas on appelle une mobilité électrophorétique négatif il faut noter que les les molécules neutres ne sont pas concernées par ce phénomène les ions lorsqu'ils

Speaker A

sont soumis à un chon électrique se déplacent à une vitesse caractéristique constante qui fonction de leur taille et de leur charge c'est-à-dire un ion sera d'autant plus mobile que sa charge est élevé et que ce et que sa taille ou son

Speaker A

rayon ionique sera faible par contre l'électroosmose c'est quoi c'est un phénomène particulier au capillaire de silice correspondant à l'écoulement d'un liquides remplissant un capillaire don la paroie interne possède une charge de surface lorsque celle-ci est soumis à un

Speaker A

champ électrique tangentielle je m'explique par ce schéma qui représente le capillaire de l'électroporèse alors la paroie interne elle est formée de Silic donc des groupement célanol qui sont très très acides ils vont perdre des protons il donnent facilement des

Speaker A

groupement célanol chargé négativement dès que le pH est supérieur à 2 ce qui confèt au capillaire une charge négative interne par la suite lorsque le capillaire est rempli du temppon électrophoritique bien sûr le miniap il va aspirer du ton en premier lieu le ton

Speaker A

il contient des C donc les ils vont s'absorber à la paroie interne du capillaire pour neutraliser les charges négatives de la paroie interne et lorsque on impose une tension dans le capillaire la solution bien le tpon sera entraîné vers la cathode par la création

Speaker A

d'un flux le flux électroosmose c'est-à-dire la direction toujours du plus vers le MO ou de l'anode vers la cathode le sens par contre pour la migration électrophorétique si la substance allait séparé sont des cations donc ils vont être migrés vers la cathode chargée

Speaker A

négativement et le sens du flux électrophorétique il est de dans le même sens que le flux électro-osmose par contre si la substance a séparé sont des anions comme les protéines chargées négativement ils vont être migrés vers l'Ane c'est-à-dire

Speaker A

dans ce sens donc la migration électrophorétique a un sens opposé que le flux électroosmose à la fin une fois les protéines sont séparé ils vont être détectés par système d'acquisition des données pour nous donner à la fin un

Speaker A

tracé électrophorétique maintenant quels sont les avantages de l'électroforesse capillaire alors c'est une technique très efficace la résolution elle est très é V rquide euh automatisation des séparations conditionnement aé du capillaire de séparation faible consommation des échantillons et de tons

Speaker A

de séparation par rapport à l'électroporèse sur gel et la compatibilité avec de nombreux détecteurs à savoir la conductimétrie la fluurométrie UV et la spectrométrie de masse l'électroporèes des protéines plasmatiques sont indiquées en cas d'altération de l'état général syndrome

Speaker A

inflammatoire inexpliqué des douleurs euh osseuses ou articulaires inexpliquées des perturbations hépathtiques soit cliniques et biologiques euh des euh infections à répétition une hypercalcémie et en cas d'insuffisance rénale récente si euh par exemple au niveau de tracé électrophoritique on a

Speaker A

trouvé un pic monoclonal alors la démarche à suivre euh c'est de faire une automatiquement la technique d'éminofixation des protéines alors c'est quoi c'est une technique qualitative appliqué à la révélation et l'identification des immunoglobulines monoclonales dans le sérum les urine et

Speaker A

éventuellement le LCM une immunoglobuline monoclonale comme on le sait c'est une immunoglobuline produite en quantité anormale par un clone unique de lymphocyte B elle est constitué soit d'une seule classe de chaînes légère et de chaînes lourde dans ce cas

Speaker A

l'immunoglobuline elle est entière soit on peut trouver de chaînes légères isolées d'un seul type ou rarement de chaînes lourdes mais en général elle est fragmentaire alors quel est le principe de cette technique donc euh permet de séparer les protéines par électropores

Speaker A

puis on fait une précipitation des différentes immunoglobulines à l'IDE d'anticorps mono spécifique à savoir les anticorps anti IgG IgA IgM Ka et Landa et enfin on effectue une coloration des immunoglobulines précipitées voici un schéma par exemple le patient had il

Speaker A

présente un pic monoclonal de type IgM avec chaî légère Londa et l'intérêt de la technique d'immunofixation c'est le diagnostic de miéom multiple et W STR parmi l'exploration de biologique des dprotéinémie le dosage spécifique d'une protéine donnée par exemple le dosage de

Speaker A

l'albumine par la méthode de verre de promogrésol quel est le principe de C technique alors c'est simple au milieu acide à pH 4,2 et en présence du tampon succinate le le verre de bromocrésol se fixe sélectivement sur l'albumine en

Speaker A

donnant une coloration bleue la longueur d'Ô c'est à 610 nanomè la limite de linéarité elle est de 70 g par litre et les nombrees de l'albumine dans le son c'est entre 32 et 45 g par litre on a

Speaker A

aussi d'autres méthodes euh on a pour le dosage d'une Protée donnée on a les méthodes immunométriques automatisées à savoir la turbidimétrie nephilimétrie ce sont des méthodes immunochimique d'immunoprécipitation euh qui permett de détecter la formation du complexe imun insoluble des protéines dans les urines

Speaker A

l' lcir ou le sang par contre les méthodes immunomarquage sont utilisé uniquement pour le dosage des protéines à faible concentration exemple les hormones basé sur l'utilisation des traceurs à savoir les fluurescant les composés chimi luminissant des enzymes comme la p péroxydase radioisotope comme

Speaker A

l'iode l'iode 125 et les luminissant et voilà j'ai terminé la partie pratique sur l'exploration biologique des dysprinémies j'espère je vous ai éclairci un peu les choses et merci de votre attention

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Frequently Asked Questions

Qu'est-ce que les dysprotéinémies ?

Les dysprotéinémies sont des perturbations quantitatives des protéines plasmatiques, caractérisées par une augmentation ou une diminution des protéines totales, d'un groupe ou d'une seule protéine plasmatique.

Pourquoi utilise-t-on la méthode de Biuret pour doser les protéines totales ?

La méthode de Biuret est utilisée car elle est simple, rapide, fiable et automatisable. Elle repose sur la formation d'un complexe violet pourpre entre les ions cuivre et les liaisons peptidiques dans un milieu alcalin, proportionnel à la concentration protéique.

Quelle est la différence entre l'électrophorèse sur gel et l'électrophorèse capillaire ?

L'électrophorèse sur gel sépare les protéines selon leur charge et taille sur un support solide, tandis que l'électrophorèse capillaire est une technique plus récente, offrant une meilleure résolution, rapidité et compatibilité avec divers détecteurs pour l'analyse qualitative et quantitative.

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