Лекция 5 МИФИ — Transcript

Здравствуйте, уважаемые студенты. Мы продолжаем лекцию, посвящённую методам оптического имиджинга. А сейчас мы поговорим о флорофорах, применяемых в оптическом биомеджинге. Что же может являться флуорофором для оптического имиджинга? Это могут быть антитела, конъюгированные с флуоресцентными метками, это могут быть флуоресцентные белки, кальций-чувствительные, как наиболее широко используемые красители, но также и другие потенциал-зависимые. Все методы исследования биологических объектов можно подразделить на исследование фиксированных препаратов и прижизненные исследования. В фиксированных препаратах обычно исследуют тонкое строение клетки, выявляя различные структуры. Наиболее распространённым для оптического имиджинга методом является использование иммуноцитохимических методов, основанных на использовании специфического иммунологического связывания антиген-антитело. Другим подходом в имиджинговых исследованиях являются прижизненные исследования. В последнем десятилетии широкое распространение получило использование для визуализации различных клеточных структур с высоким пространственным разрешением в качестве флуоресцентных маркеров зелёного флуоресцентного белка, а также его вариантов и гомологов, составляющих семейство GFP-подобных белков. Для функционального имиджинга, характеризующего метаболические изменения в клетках, используются химические ионы и потенциал-зависимые. При использовании иммуноцитохимических методов, основанных на использовании специфического иммунологического связывания антиген-антитело, для визуализации места связывания антигена с антителом используются различные флуорохромы. Данные метки могут быть присоединены как к первичным антителам (прямой метод), так и ко вторичным (непрямой метод). Данный метод позволяет детально исследовать химический состав и строение клеток. При иммуноцитохимических исследованиях одной из ключевых стадий является фиксация препарата. Необходимо тщательно подбирать протокол фиксации с учётом особенностей изучаемого антигена. Важнейшей задачей подбора процедуры фиксации является максимально сохранить структуру объекта и обеспечить химическую сохранность интересующего нас антигена. Использование иммуноцитохимических методов позволяет детально исследовать разнообразные структуры, например, нервных клеток. На слайде вы видите схему непрямого иммуногистохимического метода. Дело в том, что первичные антитела сначала связываются с антигеном исследуемого организма, а вторичные антитела, несущие флуоресцентную метку, для расхода связываются с первичными антителами. К достоинствам иммуногистохимических методов можно отнести высокую специфичность к конкретным химическим веществам и определение их точной локализации, возможность с помощью конфокальной лазерной и мультифотонной микроскопии при использовании флуоресцентных красителей создавать высокоточные трёхмерные конструкции, возможность сочетать выявление нервных элементов с гистохимическим окрашиванием мускулатуры животного с помощью фаллоидина, что даёт возможность для изучения их пространственных взаимоотношений. Недостатком иммуногистохимических методов можно отнести отсутствие возможности выявлять общую цитоархитектонику нервной системы, включая локализацию клеточных тел, так и её отдельных отделов. Невозможно выявить детально форму клеток. В последнее десятилетие широкое распространение получило использование для визуализации различных клеточных структур с высоким пространственным разрешением в качестве флуоресцентных маркеров зелёного флуоресцентного белка, а также его вариантов и гомологов, составляющих семейство GFP-подобных белков. В отличие от других природных пигментов, GFP-белкам не требуются дополнительные ферментные системы или кофакторы для формирования флуорофора, кроме молекулярного кислорода. Таким образом, образование хромофора и возникновение свечения происходит непосредственно в живых организмах, тканях или клетках. Концевые фрагменты флуоресцентных белков доступны для связывания с другими белками, что позволяет осуществлять ошибку белков с белками-мишенями. Эти свойства делают флуоресцентные белки уникальными генетически кодируемыми флуоресцентными маркерами, незаменимым инструментом для изучения взаимодействия белков, клеточных органелл, целых клеток, их локализации, внутриклеточного транспорта и создания молекулярных биосенсоров различных внутриклеточных метаболитов. В настоящее время белки широко используются для флуоресцентного мечения белков, органелл, клеток и целых организмов, как прокариот, так и эукариот. Зелёный флуоресцентный белок — белок, синтезируемый отдельными видами медуз, которые флуоресцируют зелёным светом под воздействием синего света. Обнаружен в 1962 году у люминесценции медузы Aequorea victoria, за что эти учёные Шимомура в 2008 году получили Нобелевскую премию. В 1992 году осуществили клонирование гена, кодирующего данный белок, кодирующий GFP-ген в сочетании с различными регуляторными промоторами и элементами, что используется в качестве репортерного гена в экспериментах на культурах клеток и при работе с трансгенными организмами. GFP мало токсичен для клеток, устойчив к действию протеиназ и высоких температур, не активируется под действием детергентов, оказывает минимальное влияние на подвижность и локализацию гибридного белка-партнёра. Всё это делает его чрезвычайно удобным для использования в инженерных конструкциях. Путём мутации, замены одной аминокислоты был получен улучшенный белок, он получил название EGFP. В дальнейшем российскому учёному Лукьянову с коллегами удалось получить из кораллов класса антозоа белки, подобные GFP, в зелёной, жёлтой, красной областях спектра. Подобные белки используются для многоцветного мечения внутриклеточных структур. Их используют для анализа экспрессии генов, прижизненного мечения организмов, тканей, клеток, клеточных структур и белков. С помощью GFP-белков можно метить организмы или отдельные группы клеток, можно следить при этом за локализацией белков в живых клетках. Можно отметить отдельные клеточные структуры, например, ядро, митохондрии, комплекс Гольджи, эндоплазматический ретикулум. Возможность одновременного использования нескольких флуоресцентных белков с различными спектральными характеристиками привела к развитию новых методов оптической микроскопии, позволяющих изучать многофакторные процессы в живой клетке и в целом организме. Вот то, что вы видите на слайде, — это не раскрашено фломастерами или цветными карандашами, как раз с помощью флуорофоров удалось окрасить его различные органеллы клетки, а затем с помощью конфокального микроскопа сделать фотографию, снимок. С помощью флуоресцентных белков можно, например, пометить клетки, такие как бета-клетки поджелудочной железы, и наблюдать за выработкой инсулина в режиме реального времени. Широкое использование флуоресцентные белки получили при скрининге лекарственных препаратов. Можно привести такой пример: сейчас следует различные онкологические препараты мышам. Чаще всего используются для этой цели мыши — лабораторные животные, и прививают опухолевые клетки, помеченные флуорофором, в частности GFP-белком, и затем с помощью конфокального микроскопа можно рассматривать процесс развития пролиферации опухоли. При этом в контрольной группе, допустим, опухоль будет развиваться, а в другой группе осуществляется лечение лекарственными препаратами, и можно следить, насколько замедляется или уменьшается развитие опухоли, можно отметить наступление ремиссии. Это очень перспективный, многообещающий метод, который широко уже используется в различных доклинических исследованиях. На слайде можно увидеть примеры использования флуоресцентных белков в различных биомедицинских исследованиях, где они нашли применение в мечении различных клеточных органелл. То, что вы уже видели в мечении клеток, в мечении каких-то биологических организмов в целом, можно пометить генпромотор, можно их использовать при скрининге лекарств, можно с помощью наблюдать выделения различных активных форм кислорода. Используемые биологические метки, клетки, помеченные ими, могут выступать в роли различных биосенсоров, а можно их использовать для наблюдения взаимодействия между различными...

кальций чувствительные как наиболее широко используемые красители но также и другие потенциал зависимости все методы исследования биологических объектов можно подразделить на исследование фиксированных препаратов и прижизненные исследования фиксированных препаратах обычно исследует тонкое строение клетки выявляя различные структуры наиболее распространенным для

оптического имиджинга методом является использование иммуноцитохимических методов основанных на использовании специфического иммунологического связывания антиген-антитела другим подходом в имиджинговых исследованиях являются прижизненные исследования последняя десятилетие Широкая распространение получило использование для визуализации различных клеточных структур с высоким пространственным разрешением в качестве флюоресцентных маркеров зеленого

флюоресцентного белка а также его вариантов и гомологов составляющих семейства gfp подобных белков для функционального имиджанга характеризующего метаболические изменения в клетках используются химические Иона и потенциал зависимости при использовании иммуноцитохимических методов основанных на использовании специфического иммунологического связывания антиген антитела для

визуализации места связывания антигена с антителом используется различные флорахромы данные метки могут быть присоединены как первичным антителам прямой метод так и к вторичным непрямой мир данный метод позволяет детально исследовать химический состав и строение клеток при иммуности этой химических исследованиях одной из ключевых стадий

является фиксация препарата необходимо тщательно подбирать протокол фиксации с учетом особенностей изучаемого антигена важнейшие задачей подбора процедуры фиксации является максимально сохранить структуру объекта и обеспечить химическую сохранность интересующего нас антигена использование иммуноцитохимических методов позволяет детально исследовать разнообразные структуры например нервных

клеток на слайде вы видите схему не прямого иммуногистического метода Дело в том что первичные антитела сначала связываются с антигеном исследуемого организмам а вторичные антитела несущие флюоресцентную метку для расхода связываются с первичными антителами к достоинствам иммуны гистохимических методах можно отнести высокую

специфичность конкретным химическим веществам и определение их точной локализации возможность с помощью конфокальной лазерной и мультифотонные микроскопии при использовании флюоресцентных красителей создавать высокоточные трехмерные конструкции возможность сочетать выявление нервных элементов с гистохимическим окрашиванием мускулатуры животного с помощью фаллоедина дает возможность для изучения их

пространственных взаимоотношений недостатком иммуногистохимических методов можно отнести отсутствие возможности выявлять общую цито-архитектонику нервной системы включая локализацию клеточных тел так и ее отдельных отделов невозможно выявить детально форму клеток последнее десятилетие широкое распространение получило использование для визуализации различных клеточных структур с высоким пространственным

разрешение в качестве флюоресцентных маркеров зеленого флиоресцентного белка а также его вариантов и гомологов составляющих семейства gfp подобных белков в отличие других природных пигментов gft потом белкам не требуется дополнительные ферментные системы или по факторы для формирования флорафона кроме молекулярного кислорода

таким образом образование хромофора и возникновения свечения происходит непосредственно в живых организмах танях или клетках концевые фрагменты флюоресцентных белков доступны для связывания с другими белками то позволяет осуществлять ошибку белков белками мишенями эти свойства делают флуоресцентные белки уникальными генетически кодируемыми

флёдосцентными маркерами незаменимым инструментом для изучения взаимодействия белков клеточных органелл целых клеток их локализации внутриклеточного транспорта и создания молекулярных биосенсоров различные внутриклеточные метаболиты настоящее время белки широко используются для флоресцентного мечения белков органел клеток и целых организмов как прокариот так и эукариот

зеленый флетестный белок белок синтезируемый отдельными видами медуз которые флюорицируют зеленым светом под воздействием синего Света обнаружен 6 и белок впервые был сыном уреакторами 1962 году у люминесценцию медузы акваре и Виктория за что эти учёные шимаму 2008 году получили Нобелевскую премию

1992 году осуществили клонирование Гена кодирующего данные белок кодирующий jsp Gen в сочетании с различными регуляторными промотанными элементами Что такое используется в качестве репортерного Гена в экспериментах на культурах клеток и при работе с тангенными организмами gfp мало токсичен для клеток устойчив к

действию протеиназ и высоких температур не активируется под действием детогентов оказывает минимальное влияние на подвижность и локализацию гибридного белка партнера все это делает его чрезвычайно удобным для использования инженерных конструкциях путем мутации замены одной аминокислоты был получен улучшенный белок он получил

название egfp дальнейшем российскому ученому лукьянову с коллегами удалось получить из кораллов класса антозоо белки подобные gf-pe следующее в зеленый желтый красный областях Спектра [музыка] подобные белки используются для многоцветного мечения внутриклеточных структур Их используют для анализа экспрессии генов прижизненного мечения организмов

тканей клеток клеточных структур и белков с помощью gfp белков можно метить организмы или отдельные группы клеток можно следить при этом за локализацией белков в живых клетках можно отметить отдельные клеточные структуры например ядро митохондрии комплекс гольджи эндоплазматический ретикулов возможность одновременного использования

нескольких флюоресцентных белков с различными спектральными характеристиками привела к развитию новых методов оптической микроскопии позволяющих изучать много факторные процессы в живой клетке и в целом организме вот то что вы видите на слайде это не раскрашена фломастерами цветными карандашами как раз с помощью флорафонов удалось

окрасить или его различные органеллы клетки а затем с помощью конфокального микроскопа сделать фотографию снимок с помощью флота стентных белков Можно например пометить клетки такие как бета-клетки поджелудочной железы и наблюдать за выработкой инсулина в режиме реального времени Широкая использование флюоресцентные

белки получили при скрининге лекарствах препаратов можно привести такой пример сейчас следует различные онкологические препараты мышам чаще всего используется для этой цели мыши лабораторные животные и прививают опухолевые клетки помеченные флорафлором в частности gfp белком и затем с помощью конфокального микроскопа можно

рассматривать процесс развития пролиферации опухоли но при этом в контрольной группе допустим опухоль будет развиваться а в другой группе осуществляется лечение лекарственными препаратами и можно следить насколько замедляется или уменьшается развитие опухоли можно отметить наступление ремиссии это очень перспективный многообещающий метод

который широко уже используется в различных до клинических исследованиях на слайде можно увидеть примеры использования флуоресцентных белков в различных биомедицинских исследованиях где они нашли применение в меченье различных клеточных органел то что вы уже видели в мече не клеток в

меченье каких-то биологических организмов в целом можно пометить генпромотор можно их использовать при скрининге лекарств можно с помощью наблюдать выделения различных активных форм кислорода [музыка] используемые биологических меток клетки помечены ими могут выступать в роли различных биосенсоров а можно их использовать для наблюдения

взаимодействия между различными белками можно использовать для мечения белков и нуклеиновых кислот также обязательно нам нужно сказать про кальций и другие потенциал чувствительные красители здесь свою окраску при изменении потенциала для функционального имиджинга характеризующего метаболические изменения в клетках используют химические ионы или потенциал

зависимые красители при связывании с определенными ионами Иона зависимых красителей изменяется либо интенсивность либо Спектр существует много потенциал чувствительных красителей помимо кальция чувствительных чувствительные Коли чувствительные чувствительные и так далее чувствительные красители но наиболее распространенным его на зависимым красителям являются кальций

чувствительные красители это своего рода изменяется при связывании кальция что позволяет исследовать динамику его внутриклеточного накопления и он и кальция играет чрезвычайно важную роль в регуляции различных процессов жизнедеятельности клетки изменения концентрации кальция в цитоплазме клетки вызывает различные биологические эффекты

А так как ионы кальция действует как универсальный вторичный мессенджер внутриклеточная концентрация ионов кальция имеет большое значение в запуске и регуляции таких клеточных функций как сокращение рост секреция синоптическая передача под реферация с помощью кальция чувствительных красителей можно изучать механизмы

действия различных лекарств вот наша сегодняшняя лекция подошла к концу Благодарю за внимание