ELETTROFORESI su GEL per ANALIZZARE il DNA — Transcript

Abbiamo appena effettuato una PCR.

Come facciamo a sapere che tutto è andato bene?

Come facciamo a sapere che la reazione a catena della polimerasi ha funzionato?

Utilizzando l'elettroforesi su gel, una tecnica di laboratorio che serve a separare i frammenti di DNA in base alle loro dimensioni.

Parliamo adesso dell'elettroforesi su gel.

L'elettroforesi su gel è una tecnica di laboratorio che serve a separare i frammenti di DNA in base alle loro dimensioni e alla loro carica.

In realtà si può utilizzare l'elettroforesi su gel anche per separare molecole di RNA o proteine, ma restiamo sul DNA.

Tutte le molecole di DNA hanno la stessa quantità di carica per massa.

E allora, l'elettroforesi su gel separa i frammenti di DNA solo in base alle loro dimensioni.

Come spesso facciamo, partiamo dall'analisi dei termini.

Elettroforesi è un termine composto dal prefisso elettro, che si riferisce all'utilizzo di elettricità nella tecnica.

E dal suffisso foresi, che deriva dal greco foresis, che significa trasporto.

Su gel, perché il trasporto tramite elettricità coinvolge un gel.

Nell'elettroforesi su gel, i campioni vengono separati facendoli muovere.

In gergo correre in un gel attraverso l'utilizzo dell'elettricità.

Ma andiamo con ordine.

Primo step di una elettroforesi su gel è.

Il gel utilizzato nell'elettroforesi è solitamente un gel di agarosio.

E si prepara sciogliendo ad alta temperatura l'agarosio, un polisaccaride che viene estratto da un'alga, in una soluzione acquosa detta buffer.

Dopo che l'agarosio si è completamente e uniformemente sciolto, la soluzione viene versata all'interno di uno stampo.

Per permetterne la solidificazione, ovvero la formazione di una lastra di materiale gelatinoso.

Occhio, in questo step è importantissimo non dimenticarsi di inserire un pettinino, di solito di plastica, ad una delle due estremità, al suo posto, nello stampo.

Il pettinino serve, infatti, a permettere la formazione dei pozzetti, degli spazi rimasti vuoti, cioè senza gel.

Diciamo dei solchi nel gel, che saranno fondamentali nello step di caricamento dei campioni da analizzare.

Prima di andare avanti, vi devo chiedere di immaginare il gel.

A livello molecolare, come una rete di pori.

Questi pori consentono di separare le molecole in base alla loro grandezza.

E il gel funge, quindi, da setaccio.

La larghezza delle maglie del gel dipende dalla concentrazione di agarosio nel gel.

E viene scelta in base al tipo di molecole di DNA che si vuole analizzare.

Se DNA di grandi dimensioni, abbiamo bisogno di avere pori grandi nel gel.

In modo da permettere il passaggio di DNA di grandi dimensioni.

In questo caso, scegliamo una concentrazione di agarosio più bassa.

Se dobbiamo analizzare DNA di piccole dimensioni, invece, abbiamo bisogno di avere pori piccoli nel gel.

In modo da aumentare la risoluzione della separazione.

In questo caso, scegliamo una concentrazione di agarosio più alta.

Dopo lo step di preparazione del gel, mi raccomando ai pozzetti.

Questo viene posizionato all'interno di un contenitore per elettroforesi.

Il contenitore per l'elettroforesi, detto cella elettroforetica, in questo caso orizzontale.

È una piccola vasca con un'importante peculiarità.

È collegato ad un elettrodo positivo da un lato e ad un elettrodo negativo dall'altro.

Per procedere, bisogna posizionare il gel solido appena preparato nella cella elettroforetica.

E versarci sopra, fino a copertura del gel, una soluzione acquosa detta buffer.

Fondamentale è l'orientamento con cui si inserisce il gel nella cella elettroforetica.

Il lato del gel con i pozzetti deve essere posizionato dalla parte dell'elettrodo negativo.

Il lato del gel senza pozzetti deve essere posizionato dalla parte dell'elettrodo positivo.

Posizionato il gel e versato il buffer sopra di esso, è il momento di caricare all'interno dei pozzetti.

All'interno dei solchi del gel creati dal pettinino, i campioni di DNA da analizzare, addizionati con un buffer di caricamento.

La composizione del buffer di caricamento è pensata per appesantire i campioni di DNA, in modo tale da farli depositare sul fondo del pozzetto.

E per permettere allo sperimentatore di seguire visivamente la corsa su gel e accorgersi di quando la corsa elettroforetica è terminata.

Ultimo step, dopo il caricamento dei campioni nei pozzetti, è quello di collegare gli elettrodi alla corrente.

Per permettere alla corrente di iniziare a fluire attraverso il gel e, quindi, far partire la corsa elettroforetica.

Ora, se vi ricordate, le molecole di DNA sono complessivamente cariche negativamente a causa dei molti gruppi fosfato.

Presenti nello scheletro zucchero fosfato che costituisce i due filamenti del DNA.

In quanto cariche negativamente, le molecole di DNA, una volta fatta partire la corsa elettroforetica.

Tendono a correre verso il polo positivo.

I campioni di DNA devono essere caricati al polo negativo della cella elettroforetica.

Perché, in questo modo, il DNA può muoversi dal polo negativo a quello positivo.

Ed ecco spiegato perché è fondamentale posizionare i pozzetti.

I solchi del gel in cui vengono caricati i campioni di DNA, dal lato dell'elettrodo negativo.

Al termine dell'elettroforesi o corsa elettroforetica, cioè quando i frammenti di DNA.

Presenti nei campioni da analizzare, hanno corso a sufficienza.

Bisogna analizzare i risultati.

Riprendete l'immagine mentale che vi avevo chiesto di farvi.

Del gel a livello molecolare.

L'immagine di una rete di pori che fa da setaccio.

Questa immagine ci permette adesso di capire perché le molecole di DNA più piccole, riuscendo ad infilarsi più facilmente nei pori del gel.

Corrono più lontano dai pozzetti.

Rispetto alle molecole di DNA più grandi che, infilandosi meno facilmente nei pori del gel, restano più vicine ai pozzetti.

Capito questo concetto alla base dell'analisi dei risultati di un elettroforesi su gel.

Ci manca solo di capire come rendere visibili i campioni di DNA che hanno corso nel gel.

Ci manca allora di parlare dei coloranti per l'elettroforesi.

I coloranti per l'elettroforesi sono molecole intercalanti.

Cioè molecole che si inseriscono all'interno della struttura delle molecole di DNA, rendendole visibili alla luce UV.

Questi coloranti possono essere aggiunti direttamente nella preparazione del gel.

O essere aggiunti ai campioni di DNA prima del loro caricamento nei pozzetti.

L'utilizzo dei coloranti che si intercalano al DNA permette la visualizzazione dei frammenti di DNA sotto forma di bande brillanti.

All'interno del gel esposto ai raggi UV.

I DNA ladder, infine, sono marcatori dimensionali.

Cioè prodotti commerciali che si fanno correre nel gel insieme ai campioni da analizzare e che funzionano da standard.

In quanto contenenti frammenti di DNA di dimensioni note.

Un DNA ladder, in pratica, è uno standard che si usa per comparare le bande di DNA presenti nei campioni.

Con bande di DNA di dimensioni note.

I DNA ladder vengono venduti corredati da un'immagine leggenda che affianca ad ogni banda elettroforetica.

Del marcatore le sue dimensioni in paia di basi.

La comparazione tra la corsa elettroforetica dei campioni da analizzare e la corsa elettroforetica dei frammenti di dimensione nota presenti nel DNA ladder.

Permette di ottenere una stima delle dimensioni dei frammenti di DNA presenti nei campioni analizzati.

Ci siamo, allora.

Bande più vicine ai pozzetti sono costituite da frammenti di DNA più grandi.

Mentre bande più lontane dai pozzetti sono costituite da frammenti di DNA più corti.

Ma non solo.

Caricando in uno dei pozzetti un DNA ladder, dopo la corsa elettroforetica.

Possiamo confrontare le bande dei nostri campioni con le bande dei frammenti di DNA presenti nel DNA ladder.

E stimare, così, le dimensioni dei frammenti di DNA presenti nei nostri campioni.

L'elettroforesi su gel è una tecnica che serve a rendere possibile la visualizzazione di frammenti di DNA.

È una tecnica che ci permette di vedere quanti diversi tipi di frammenti di DNA sono presenti in un campione.

E di stimare le loro dimensioni.

L'elettroforesi su gel ci permette di analizzare il DNA.

Perché ci permette di vederlo.

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