**Лекция 5 МИФИ — Transcript & Summary | SozAI** Source: https://sozai.app/transcript/lekciya-5-mifi/ Лекция о методах оптического имиджинга с акцентом на использование флуорофоров и GFP-белков в биомедицинских исследованиях. ## Key Takeaways - Флуорофоры и GFP-белки являются ключевыми инструментами в оптическом биомедицинском имиджинге. - Иммуноцитохимические методы позволяют высокоспецифично выявлять локализацию антигенов в клетках. - GFP и его варианты обеспечивают возможность прижизненного и многоцветного мечения клеточных структур. - Флуоресцентные белки широко используются для изучения клеточных процессов и в доклинических исследованиях лекарств. - Тщательный подбор методов фиксации и маркировки критичен для сохранения структуры и функциональности исследуемых объектов. ## What the video covers - Обзор методов оптического имиджинга с использованием флуорофоров, включая антитела с флуоресцентными метками и флуоресцентные белки. - Разделение исследований на фиксированные препараты и прижизненные исследования с применением иммуноцитохимических методов. - Описание непрямого иммуногистохимического метода с использованием первичных и вторичных антител. - Преимущества и ограничения иммуногистохимических методов для изучения клеточных структур и нервной системы. - Подробное рассмотрение зелёного флуоресцентного белка (GFP), его свойства и применение в биомедицинских исследованиях. - История открытия GFP и его клонирование, а также создание улучшенного варианта EGFP. - Использование GFP и его гомологов для многоцветного мечения клеточных органелл и анализа экспрессии генов. - Примеры применения флуоресцентных белков для прижизненного мечения клеток и наблюдения биологических процессов в реальном времени. - Применение флуоресцентных белков в доклинических исследованиях, включая скрининг онкологических препаратов на лабораторных животных. - Важность флуоресцентных маркеров для создания трёхмерных изображений и изучения пространственных взаимоотношений в клетках. Answers ## Questions about this video Что такое флуорофоры и как они используются в оптическом имиджинге? Флуорофоры — это молекулы, способные излучать свет при возбуждении. В оптическом имиджинге они используются для маркировки антител, белков и других структур, что позволяет визуализировать биологические объекты с высокой специфичностью и разрешением. В чем преимущество использования GFP-белков в биомедицинских исследованиях? GFP-белки не требуют дополнительных ферментов для свечения, могут использоваться в живых клетках и организмах, обеспечивают многоцветное мечение и позволяют наблюдать динамические процессы в реальном времени. Какие ограничения имеют иммуногистохимические методы в изучении нервной системы? Иммуногистохимические методы не позволяют детально выявлять общую цитоархитектонику нервной системы и форму клеток, ограничивая возможность комплексного анализа структуры и локализации клеточных тел. ## Full Transcript — Download SRT & Markdown 00:15 Speaker A Здравствуйте, уважаемые студенты. Мы продолжаем лекцию, посвящённую методам оптического имиджинга. А сейчас мы поговорим о флорофорах, применяемых в оптическом биомеджинге. Что же может являться флуорофором для оптического имиджинга? Это могут быть антитела, конъюгированные с флуоресцентными метками, это могут быть флуоресцентные белки, кальций-чувствительные, как наиболее широко используемые красители, но также и другие потенциал-зависимые. Все методы исследования биологических объектов можно подразделить на исследование фиксированных препаратов и прижизненные исследования. В фиксированных препаратах обычно исследуют тонкое строение клетки, выявляя различные структуры. Наиболее распространённым для оптического имиджинга методом является использование иммуноцитохимических методов, основанных на использовании специфического иммунологического связывания антиген-антитело. Другим подходом в имиджинговых исследованиях являются прижизненные исследования. В последнем десятилетии широкое распространение получило использование для визуализации различных клеточных структур с высоким пространственным разрешением в качестве флуоресцентных маркеров зелёного флуоресцентного белка, а также его вариантов и гомологов, составляющих семейство GFP-подобных белков. Для функционального имиджинга, характеризующего метаболические изменения в клетках, используются химические ионы и потенциал-зависимые. При использовании иммуноцитохимических методов, основанных на использовании специфического иммунологического связывания антиген-антитело, для визуализации места связывания антигена с антителом используются различные флуорохромы. Данные метки могут быть присоединены как к первичным антителам (прямой метод), так и ко вторичным (непрямой метод). Данный метод позволяет детально исследовать химический состав и строение клеток. При иммуноцитохимических исследованиях одной из ключевых стадий является фиксация препарата. Необходимо тщательно подбирать протокол фиксации с учётом особенностей изучаемого антигена. Важнейшей задачей подбора процедуры фиксации является максимально сохранить структуру объекта и обеспечить химическую сохранность интересующего нас антигена. Использование иммуноцитохимических методов позволяет детально исследовать разнообразные структуры, например, нервных клеток. На слайде вы видите схему непрямого иммуногистохимического метода. Дело в том, что первичные антитела сначала связываются с антигеном исследуемого организма, а вторичные антитела, несущие флуоресцентную метку, для расхода связываются с первичными антителами. К достоинствам иммуногистохимических методов можно отнести высокую специфичность к конкретным химическим веществам и определение их точной локализации, возможность с помощью конфокальной лазерной и мультифотонной микроскопии при использовании флуоресцентных красителей создавать высокоточные трёхмерные конструкции, возможность сочетать выявление нервных элементов с гистохимическим окрашиванием мускулатуры животного с помощью фаллоидина, что даёт возможность для изучения их пространственных взаимоотношений. Недостатком иммуногистохимических методов можно отнести отсутствие возможности выявлять общую цитоархитектонику нервной системы, включая локализацию клеточных тел, так и её отдельных отделов. Невозможно выявить детально форму клеток. В последнее десятилетие широкое распространение получило использование для визуализации различных клеточных структур с высоким пространственным разрешением в качестве флуоресцентных маркеров зелёного флуоресцентного белка, а также его вариантов и гомологов, составляющих семейство GFP-подобных белков. В отличие от других природных пигментов, GFP-белкам не требуются дополнительные ферментные системы или кофакторы для формирования флуорофора, кроме молекулярного кислорода. Таким образом, образование хромофора и возникновение свечения происходит непосредственно в живых организмах, тканях или клетках. Концевые фрагменты флуоресцентных белков доступны для связывания с другими белками, что позволяет осуществлять ошибку белков с белками-мишенями. Эти свойства делают флуоресцентные белки уникальными генетически кодируемыми флуоресцентными маркерами, незаменимым инструментом для изучения взаимодействия белков, клеточных органелл, целых клеток, их локализации, внутриклеточного транспорта и создания молекулярных биосенсоров различных внутриклеточных метаболитов. В настоящее время белки широко используются для флуоресцентного мечения белков, органелл, клеток и целых организмов, как прокариот, так и эукариот. Зелёный флуоресцентный белок — белок, синтезируемый отдельными видами медуз, которые флуоресцируют зелёным светом под воздействием синего света. Обнаружен в 1962 году у люминесценции медузы Aequorea victoria, за что эти учёные Шимомура в 2008 году получили Нобелевскую премию. В 1992 году осуществили клонирование гена, кодирующего данный белок, кодирующий GFP-ген в сочетании с различными регуляторными промоторами и элементами, что используется в качестве репортерного гена в экспериментах на культурах клеток и при работе с трансгенными организмами. GFP мало токсичен для клеток, устойчив к действию протеиназ и высоких температур, не активируется под действием детергентов, оказывает минимальное влияние на подвижность и локализацию гибридного белка-партнёра. Всё это делает его чрезвычайно удобным для использования в инженерных конструкциях. Путём мутации, замены одной аминокислоты был получен улучшенный белок, он получил название EGFP. В дальнейшем российскому учёному Лукьянову с коллегами удалось получить из кораллов класса антозоа белки, подобные GFP, в зелёной, жёлтой, красной областях спектра. Подобные белки используются для многоцветного мечения внутриклеточных структур. Их используют для анализа экспрессии генов, прижизненного мечения организмов, тканей, клеток, клеточных структур и белков. С помощью GFP-белков можно метить организмы или отдельные группы клеток, можно следить при этом за локализацией белков в живых клетках. Можно отметить отдельные клеточные структуры, например, ядро, митохондрии, комплекс Гольджи, эндоплазматический ретикулум. Возможность одновременного использования нескольких флуоресцентных белков с различными спектральными характеристиками привела к развитию новых методов оптической микроскопии, позволяющих изучать многофакторные процессы в живой клетке и в целом организме. Вот то, что вы видите на слайде, — это не раскрашено фломастерами или цветными карандашами, как раз с помощью флуорофоров удалось окрасить его различные органеллы клетки, а затем с помощью конфокального микроскопа сделать фотографию, снимок. С помощью флуоресцентных белков можно, например, пометить клетки, такие как бета-клетки поджелудочной железы, и наблюдать за выработкой инсулина в режиме реального времени. Широкое использование флуоресцентные белки получили при скрининге лекарственных препаратов. Можно привести такой пример: сейчас следует различные онкологические препараты мышам. Чаще всего используются для этой цели мыши — лабораторные животные, и прививают опухолевые клетки, помеченные флуорофором, в частности GFP-белком, и затем с помощью конфокального микроскопа можно рассматривать процесс развития пролиферации опухоли. При этом в контрольной группе, допустим, опухоль будет развиваться, а в другой группе осуществляется лечение лекарственными препаратами, и можно следить, насколько замедляется или уменьшается развитие опухоли, можно отметить наступление ремиссии. Это очень перспективный, многообещающий метод, который широко уже используется в различных доклинических исследованиях. На слайде можно увидеть примеры использования флуоресцентных белков в различных биомедицинских исследованиях, где они нашли применение в мечении различных клеточных органелл. То, что вы уже видели в мечении клеток, в мечении каких-то биологических организмов в целом, можно пометить генпромотор, можно их использовать при скрининге лекарств, можно с помощью наблюдать выделения различных активных форм кислорода. Используемые биологические метки, клетки, помеченные ими, могут выступать в роли различных биосенсоров, а можно их использовать для наблюдения взаимодействия между различными... 00:45 Speaker A кальций чувствительные как наиболее широко используемые красители но также и другие потенциал зависимости все методы исследования биологических объектов можно подразделить на исследование фиксированных препаратов и прижизненные исследования фиксированных препаратах обычно исследует тонкое строение клетки выявляя различные структуры наиболее распространенным для 01:14 Speaker A оптического имиджинга методом является использование иммуноцитохимических методов основанных на использовании специфического иммунологического связывания антиген-антитела другим подходом в имиджинговых исследованиях являются прижизненные исследования последняя десятилетие Широкая распространение получило использование для визуализации различных клеточных структур с высоким пространственным разрешением в качестве флюоресцентных маркеров зеленого 01:47 Speaker A флюоресцентного белка а также его вариантов и гомологов составляющих семейства gfp подобных белков для функционального имиджанга характеризующего метаболические изменения в клетках используются химические Иона и потенциал зависимости при использовании иммуноцитохимических методов основанных на использовании специфического иммунологического связывания антиген антитела для 02:20 Speaker A визуализации места связывания антигена с антителом используется различные флорахромы данные метки могут быть присоединены как первичным антителам прямой метод так и к вторичным непрямой мир данный метод позволяет детально исследовать химический состав и строение клеток при иммуности этой химических исследованиях одной из ключевых стадий 02:44 Speaker A является фиксация препарата необходимо тщательно подбирать протокол фиксации с учетом особенностей изучаемого антигена важнейшие задачей подбора процедуры фиксации является максимально сохранить структуру объекта и обеспечить химическую сохранность интересующего нас антигена использование иммуноцитохимических методов позволяет детально исследовать разнообразные структуры например нервных 03:14 Speaker A клеток на слайде вы видите схему не прямого иммуногистического метода Дело в том что первичные антитела сначала связываются с антигеном исследуемого организмам а вторичные антитела несущие флюоресцентную метку для расхода связываются с первичными антителами к достоинствам иммуны гистохимических методах можно отнести высокую 03:45 Speaker A специфичность конкретным химическим веществам и определение их точной локализации возможность с помощью конфокальной лазерной и мультифотонные микроскопии при использовании флюоресцентных красителей создавать высокоточные трехмерные конструкции возможность сочетать выявление нервных элементов с гистохимическим окрашиванием мускулатуры животного с помощью фаллоедина дает возможность для изучения их 04:15 Speaker A пространственных взаимоотношений недостатком иммуногистохимических методов можно отнести отсутствие возможности выявлять общую цито-архитектонику нервной системы включая локализацию клеточных тел так и ее отдельных отделов невозможно выявить детально форму клеток последнее десятилетие широкое распространение получило использование для визуализации различных клеточных структур с высоким пространственным 04:50 Speaker A разрешение в качестве флюоресцентных маркеров зеленого флиоресцентного белка а также его вариантов и гомологов составляющих семейства gfp подобных белков в отличие других природных пигментов gft потом белкам не требуется дополнительные ферментные системы или по факторы для формирования флорафона кроме молекулярного кислорода 05:15 Speaker A таким образом образование хромофора и возникновения свечения происходит непосредственно в живых организмах танях или клетках концевые фрагменты флюоресцентных белков доступны для связывания с другими белками то позволяет осуществлять ошибку белков белками мишенями эти свойства делают флуоресцентные белки уникальными генетически кодируемыми 05:43 Speaker A флёдосцентными маркерами незаменимым инструментом для изучения взаимодействия белков клеточных органелл целых клеток их локализации внутриклеточного транспорта и создания молекулярных биосенсоров различные внутриклеточные метаболиты настоящее время белки широко используются для флоресцентного мечения белков органел клеток и целых организмов как прокариот так и эукариот 06:17 Speaker A зеленый флетестный белок белок синтезируемый отдельными видами медуз которые флюорицируют зеленым светом под воздействием синего Света обнаружен 6 и белок впервые был сыном уреакторами 1962 году у люминесценцию медузы акваре и Виктория за что эти учёные шимаму 2008 году получили Нобелевскую премию 06:52 Speaker A 1992 году осуществили клонирование Гена кодирующего данные белок кодирующий jsp Gen в сочетании с различными регуляторными промотанными элементами Что такое используется в качестве репортерного Гена в экспериментах на культурах клеток и при работе с тангенными организмами gfp мало токсичен для клеток устойчив к 07:23 Speaker A действию протеиназ и высоких температур не активируется под действием детогентов оказывает минимальное влияние на подвижность и локализацию гибридного белка партнера все это делает его чрезвычайно удобным для использования инженерных конструкциях путем мутации замены одной аминокислоты был получен улучшенный белок он получил 07:53 Speaker A название egfp дальнейшем российскому ученому лукьянову с коллегами удалось получить из кораллов класса антозоо белки подобные gf-pe следующее в зеленый желтый красный областях Спектра [музыка] подобные белки используются для многоцветного мечения внутриклеточных структур Их используют для анализа экспрессии генов прижизненного мечения организмов 08:29 Speaker A тканей клеток клеточных структур и белков с помощью gfp белков можно метить организмы или отдельные группы клеток можно следить при этом за локализацией белков в живых клетках можно отметить отдельные клеточные структуры например ядро митохондрии комплекс гольджи эндоплазматический ретикулов возможность одновременного использования 09:15 Speaker A нескольких флюоресцентных белков с различными спектральными характеристиками привела к развитию новых методов оптической микроскопии позволяющих изучать много факторные процессы в живой клетке и в целом организме вот то что вы видите на слайде это не раскрашена фломастерами цветными карандашами как раз с помощью флорафонов удалось 09:44 Speaker A окрасить или его различные органеллы клетки а затем с помощью конфокального микроскопа сделать фотографию снимок с помощью флота стентных белков Можно например пометить клетки такие как бета-клетки поджелудочной железы и наблюдать за выработкой инсулина в режиме реального времени Широкая использование флюоресцентные 10:20 Speaker A белки получили при скрининге лекарствах препаратов можно привести такой пример сейчас следует различные онкологические препараты мышам чаще всего используется для этой цели мыши лабораторные животные и прививают опухолевые клетки помеченные флорафлором в частности gfp белком и затем с помощью конфокального микроскопа можно 10:51 Speaker A рассматривать процесс развития пролиферации опухоли но при этом в контрольной группе допустим опухоль будет развиваться а в другой группе осуществляется лечение лекарственными препаратами и можно следить насколько замедляется или уменьшается развитие опухоли можно отметить наступление ремиссии это очень перспективный многообещающий метод 11:22 Speaker A который широко уже используется в различных до клинических исследованиях на слайде можно увидеть примеры использования флуоресцентных белков в различных биомедицинских исследованиях где они нашли применение в меченье различных клеточных органел то что вы уже видели в мече не клеток в 11:50 Speaker A меченье каких-то биологических организмов в целом можно пометить генпромотор можно их использовать при скрининге лекарств можно с помощью наблюдать выделения различных активных форм кислорода [музыка] используемые биологических меток клетки помечены ими могут выступать в роли различных биосенсоров а можно их использовать для наблюдения 12:26 Speaker A взаимодействия между различными белками можно использовать для мечения белков и нуклеиновых кислот также обязательно нам нужно сказать про кальций и другие потенциал чувствительные красители здесь свою окраску при изменении потенциала для функционального имиджинга характеризующего метаболические изменения в клетках используют химические ионы или потенциал 13:05 Speaker A зависимые красители при связывании с определенными ионами Иона зависимых красителей изменяется либо интенсивность либо Спектр существует много потенциал чувствительных красителей помимо кальция чувствительных чувствительные Коли чувствительные чувствительные и так далее чувствительные красители но наиболее распространенным его на зависимым красителям являются кальций 13:36 Speaker A чувствительные красители это своего рода изменяется при связывании кальция что позволяет исследовать динамику его внутриклеточного накопления и он и кальция играет чрезвычайно важную роль в регуляции различных процессов жизнедеятельности клетки изменения концентрации кальция в цитоплазме клетки вызывает различные биологические эффекты 14:11 Speaker A А так как ионы кальция действует как универсальный вторичный мессенджер внутриклеточная концентрация ионов кальция имеет большое значение в запуске и регуляции таких клеточных функций как сокращение рост секреция синоптическая передача под реферация с помощью кальция чувствительных красителей можно изучать механизмы 14:39 Speaker A действия различных лекарств вот наша сегодняшняя лекция подошла к концу Благодарю за внимание Topics: оптический имиджинг флуорофоры иммуноцитохимия зелёный флуоресцентный белок GFP биомедицинские исследования конфокальная микроскопия флуоресцентные белки биомаркеры прижизненное исследование Учить по этому видео - [Карточки по этому видео](https://sozai.app/ru/tools/ai-flashcard-generator/?from=transcript&id=30301) - [Тест по этому видео](https://sozai.app/ru/tools/quiz-generator/?from=transcript&id=30301) Бесплатно, составлено ИИ по этой расшифровке. Без регистрации. --- This is the markdown twin of https://sozai.app/transcript/lekciya-5-mifi/ — the same content, without the markup. Published by SozAI (https://sozai.app). Reuse and quotation are allowed with attribution and a link back. Machine-readable index: https://sozai.app/llms.txt · data API: https://sozai.app/api/